【摘要】：目的:細菌的非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)能夠調控細菌的許多行為,如動力、生物膜形成和毒力等。本研究前期通過對傷寒沙門菌(S.Typhi)進行高通量測序轉錄組分析,發(fā)現(xiàn)了許多非編碼RNA,其中在flhDC操縱子對側編碼的反義RNA引起了我們的注意,并將其命名為AsfD。本文旨在對AsfD進行分子鑒定,并對其表達特性和功能開展深入研究。方法:1.AsfD的分子特征鑒定:在AsfD已知序列區(qū)設計兩條特異性探針引物,通過RT-PCR和Northern雜交驗證AsfD在S.Typhi中的存在;然后運用5’RACE和RT-PCR檢測AsfD的5’端和3’端,結合Northern雜交結果分析AsfD分子全長。2.AsfD表達特性分析:用Northern雜交和qRT-PCR檢測傷寒沙門菌不同生長時期AsfD的表達;通過qRT-PCR分析傷寒沙門菌在不同應激條件下(酸、氧、高滲)AsfD的表達特性。3.AsfD高表達菌株制備:根據(jù)Northern雜交,5’RACE和RT-PCR實驗的鑒定結果,設計AsfD特異性引物,通過PCR擴增AsfD目的片段。擴增的片段包括了Nco I和EcoR I酶切位點,并克隆到載體pBAD/HisA上。構建相應的高表達菌株(WT+pBAD-asfD)和對照株(WT+pBAD)。4.細菌動力實驗:將S.Typhi的AsfD高表達菌株及空質粒對照株接種于半固體培養(yǎng)基,過夜培養(yǎng),測S.Typhi在平板上的動力圈直徑。5.細菌生物膜分析實驗:在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)AsfD高表達菌株及對照株至OD_(600)為0.4,并將菌液接種至96孔板中培養(yǎng)。96 h后用結晶紫染液對生物膜進行染色,洗脫后檢測570 nm波長處吸光度值,分析生物膜形成量。6.細菌對HeLa細胞侵襲實驗:將AsfD高表達菌株和空質粒對照株培養(yǎng)至對數(shù)早期,然后加入培養(yǎng)有HeLa細胞的24孔板中與He La細胞共孵育,比較兩個菌株對于He La細胞侵襲能力的差異。7.qRT-PCR檢測靶基因flhDC及鞭毛基因mRNA:AsfD高表達菌株和空質粒對照株培養(yǎng)至對數(shù)早期,在0.2%(w/v)阿拉伯糖誘導培養(yǎng)30 min。通過TRIzol法提取RNA,用qRT-PCR分析AsfD對flhDC、fli A和fljB的表達水平影響。8.Western blot分析鞭毛蛋白FljB:將傷寒沙門菌AsfD高表達菌株和空質粒對照株培養(yǎng)至對數(shù)早期,在0.2%(w/v)阿拉伯糖誘導培養(yǎng)0、15、30和60 min。超聲破碎,離心取上清,使用蛋白質印跡法檢測AsfD高表達菌株和空質粒對照株表達差異。結果:1.Northern雜交結果顯示,傷寒沙門菌中AsfD長約2300 nt;RACE實驗表明AsfD 5’端位于flhC基因終止密碼子下游590 bp處;RT-PCR結果表明AsfD 3’端位于flhD基因起始密碼子上游558 bp~788 bp之間。2.Northern雜交和qRT-PCR結果顯示,AsfD的表達水平隨著傷寒沙門菌的生長而增高,并且在穩(wěn)態(tài)期達到最高水平;AsfD在酸、氧、高滲應激后表達均明顯下降。3.成功構建AsfD高表達菌株(WT+pBAD-asf D)和空質粒對照株(WT+pBAD)。4.動力實驗顯示,與空質粒對照株相比,AsfD高表達菌株動力明顯增強。5.生物膜實驗顯示,與對照株相比,AsfD高表達菌株生物膜形成能力增強。6.上皮細胞侵襲實驗結果顯示,AsfD高表達菌株和對照株對He La細胞的侵襲能力無明顯變化。7.qRT-PCR結果顯示,與空質粒對照株相比,AsfD高表達菌株能夠上調flhDC、fliA和fljB mRNA的表達。8.Western blot結果顯示,與空質粒對照株相比,AsfD高表達菌株能夠上調鞭毛蛋白FljB的表達。結論:在S.Typhi中新鑒定了一個長鏈反義RNA AsfD,其分子全長在2079 nt~2310nt之間,AsfD確定的2079 nt序列能夠完全覆蓋flhDC操縱子;AsfD能增強傷寒沙門菌生物膜形成,并能通過直接上調靶基因flhDC的表達,從而增強傷寒沙門菌動力。
【圖文】：

20圖3.1 5'RACE原理圖Fig 3.1 5' RACE schematic3.2.2.2.3 5’ RACE實驗（1） 提取傷寒沙門菌總RNA，，方法同前。（2）第一條cDNA鏈合成步驟 1 如下：組份 體積5X First-Strand Buffer 4.0 μlDTT (100 mM) 0.5 μldNTPs (20 mM） 1.0 μl總體積 5.5 μl

圖 4.2 檢測探針質量Fig 4.2 The quality of pro 6000 Marker；1：RNA 樣本與特圖4.3 Northern印跡法檢測Fig 4.3 Detection of AsfD by No
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R446.5

【參考文獻】

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1 Ahmed Tawfik;Paul K Flanagan;Barry J Campbell;;Escherichia coli-host macrophage interactions in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J];World Journal of Gastroenterology;2014年27期

本文編號：2700862