【摘要】：開發(fā)精準(zhǔn)的細(xì)菌定量檢測分析技術(shù)在食品衛(wèi)生、環(huán)境衛(wèi)生、實(shí)驗(yàn)診斷等領(lǐng)域具有重要的實(shí)用價(jià)值,而靶細(xì)菌的高選擇性分離是細(xì)菌定量檢測技術(shù)取得成功的前提條件與關(guān)鍵步驟。眾所周知,傳統(tǒng)方法優(yōu)缺并存無法滿足分子生物學(xué)對細(xì)菌分離越來越精細(xì)的要求,因此開發(fā)新的高選擇性分離靶細(xì)菌的分離技術(shù)對細(xì)菌定量檢測具有重要意義。作為分離細(xì)菌的新技術(shù),細(xì)菌印跡技術(shù)是一門以靶細(xì)菌為模板通過功能單體和交聯(lián)劑來合成與靶細(xì)菌具有互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的孔穴的新技術(shù)。這種孔穴結(jié)構(gòu)能夠通過形狀、大小的匹配和化學(xué)鍵作用與靶細(xì)菌特異性結(jié)合。但是,傳統(tǒng)細(xì)菌印跡技術(shù)分離細(xì)菌的方法均只把細(xì)菌看做為BIPs(Bacterial imprinted polymers,BIPs)的模板分子,而忽視了細(xì)菌作為微生物所存在的生物學(xué)特性,因此分離效果不理想。本論文的研究思路是把細(xì)菌趨化性和細(xì)菌印跡選擇性相結(jié)合,開發(fā)一種分離細(xì)菌的新方法。本研究在保證傳統(tǒng)細(xì)菌印跡材料識別能力的基礎(chǔ)上,利用細(xì)菌趨化性產(chǎn)生的主動(dòng)識別對BIPs的吸附選擇性進(jìn)行二次增強(qiáng)。為了確保細(xì)菌印跡材料傳統(tǒng)的識別能力,本文通過表面壓印的方式制備特異性識別靶細(xì)菌的BIPs。為了實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的趨化性,微通道結(jié)構(gòu)將被引入到BIPs材料中。該微通道結(jié)構(gòu)將被應(yīng)用于引誘劑和驅(qū)避劑的釋放。在細(xì)菌吸附過程中,靶細(xì)菌趨化劑和非靶細(xì)菌驅(qū)避劑的釋放可避免非靶細(xì)菌的干擾而促使靶細(xì)菌產(chǎn)生選擇性移動(dòng)和識別以實(shí)現(xiàn)靶細(xì)菌的高選擇性分離。目的:將傳統(tǒng)的細(xì)菌印跡技術(shù)的被動(dòng)識別與細(xì)菌趨化性誘導(dǎo)的主動(dòng)識別相結(jié)合開發(fā)出比傳統(tǒng)細(xì)菌印跡材料具有更高的靶向識別選擇性、可用于混合細(xì)菌溶液中靶細(xì)菌的分離方法。方法:通過表面壓印技術(shù)制備細(xì)菌PDMS印跡膜,并用甲基三氯硅烷修飾印跡膜,最后用微針(36孔)在清洗干凈的PDMS印跡膜上致孔得到具有微通道的PDMS印跡膜。用PDMS印跡膜的印跡側(cè)朝向細(xì)菌液,非印跡側(cè)則朝向趨化劑溶液制備出可以緩慢釋放趨化劑的裝置來研究單一菌液和混合菌液中PDMS印跡膜的吸附效果和選擇性。結(jié)果:本論文通過表面印跡技術(shù)制備了可選擇性識別細(xì)菌的PDMS印跡膜;并通過微針致孔方法得到可以引入趨化劑和趨避劑的微通道PDMS印跡膜。在單一溶液中,靶細(xì)菌趨化劑可明顯增加靶細(xì)菌的吸附量,而干擾菌趨避劑也可明顯降低干擾菌的吸附量;在混合菌液中,同時(shí)增加或者減弱靶細(xì)菌、干擾菌吸附的趨避劑或趨避劑對靶細(xì)菌MIP的選擇性幾乎不產(chǎn)生影響,而只對靶細(xì)菌或者干擾菌任意一種產(chǎn)生趨化或趨避作用的趨化劑或趨避劑能增加靶細(xì)菌MIP對靶細(xì)菌的選擇性,從而實(shí)現(xiàn)靶細(xì)菌的選擇性分離。結(jié)論:基于細(xì)菌趨化劑和微通道印跡膜分離細(xì)菌的方法可同時(shí)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的被動(dòng)和主動(dòng)識別,從而提高PDMS印跡膜的選擇性以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的高選擇性分離。本研究為解決細(xì)菌印跡技術(shù)中印跡孔穴選擇性不高提出了新思路,推動(dòng)了細(xì)菌印跡技術(shù)在臨床、環(huán)境細(xì)菌檢測中的發(fā)展。
【圖文】：

1) 取 1 mL 清洗三遍的大腸桿菌菌（或金黃色葡萄球菌）懸浮液（107CFU/mL）滴加在滅菌的顯微鏡載玻片上，在 4 ℃下靜置 2 小時(shí)使細(xì)菌沉降后，剩余的溶劑在無菌通風(fēng)環(huán)境下除去。將聚二甲基硅氧烷(PDMS) 預(yù)聚體、固化劑采用環(huán)己烷溶解（體積比=2:1）并涂于玻璃片。預(yù)聚體在 80 ℃固化 4 min， 將涂有細(xì)菌的載玻片壓入上述未完全固化的 PDMS 表面并在 37 ℃下保持 7 h 后再將 PDMS 在 80 ℃繼續(xù)固化 1 h。最后剝離模板菌上的載玻片，取出印跡膜，并等面積分成圓形小片，用超聲清洗機(jī)洗滌去除模板細(xì)菌。最后將 PDMS 膜和甲基三氯硅烷放在密閉容器中，置于干燥箱 60℃烘干后，，三蒸水超聲清洗 1 min取出。用微針（36 孔）在清洗干凈的 PDMS 印跡膜上打孔，每片膜 180 個(gè)孔。（NIP 不加模板菌，其他過程同 MIP）2) 將合成的 PDMS 印跡膜和非印跡 PDMS 膜洗凈放入顯微鏡和掃描電鏡下觀察，比較 MIP 和 NIP 的差別。金黃色葡萄球菌 MIP 合成方法與上述步驟相同。

圖 2. 細(xì)菌趨化劑篩選裝置示意圖。.2.3.2 模板菌濃度的優(yōu)化1) 分別以濃度為 103、 104、105、 106、107、108CFU/mL 的大腸桿菌為模合成 PDMS 膜備用。2) 取相同面積的 PDMS 膜（MIP 和 NIP 各 3 片）粘在培養(yǎng)皿上，紫外燈照 1 h 后將 3 mL 懸浮好的大腸桿菌菌（濃度 106CFU/mL）加入培養(yǎng)皿, 37.5 ℃養(yǎng) 2 h。3) 2 h 后取出 PDMS 膜，PBS 液沖洗 PDMS 膜將表面的細(xì)菌沖洗干凈，然后入新的培養(yǎng)皿，加入 1 mL 吹打一分鐘。4) 取洗滌液稀釋 100 倍后，取 100μL 涂 LB 平板。放入 37.5 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)夜后計(jì)數(shù) LB 平板的菌落數(shù)。比較不同濃度模板菌合成的 PDMS 膜的吸吸附效。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R446.5

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本文編號：2695590