【摘要】：目的:在世界范圍內(nèi),肺癌是造成癌癥相關(guān)死亡的主要癌癥之一,其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占據(jù)了肺癌總數(shù)的百分之八十左右。因?yàn)榇蠖鄶?shù)患者確診較晚,在臨床治療中失去了手術(shù)醫(yī)治的時(shí)機(jī),患者接受傳統(tǒng)的放化療治療和靶向藥的治療來(lái)對(duì)抗癌癥。C-SRC是酪氨酸激酶家族中重要的一員,它很少發(fā)生突變并且在50-80%的肺癌患者中高表達(dá),是黏著斑激酶(FAK)復(fù)合體中的一部分,調(diào)控細(xì)胞的黏附和遷移,在肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸中起到了重要的作用,并且C-SRC蛋白介導(dǎo)了肺癌放療抵抗的產(chǎn)生。ADAM12,解整合素-金屬蛋白酶12,在肺癌中通過(guò)調(diào)整腫瘤細(xì)胞的上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)水平參與癌癥進(jìn)程的進(jìn)展,而EMT作用會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)肺癌的耐藥性和放療抵抗的獲得。SRC樣受體蛋白(SLAP)屬于造血因子受體亞族,生物學(xué)作用為阻滯細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。SLAP有一個(gè)獨(dú)特的連接著與SRC酪氨酸激酶家族高度同源的SH3和SH2末端的十八烷基化N尾端和一個(gè)同CBL緊密連接的獨(dú)特的C-尾端。證據(jù)表明SLAP負(fù)調(diào)控癌癥細(xì)胞中酪氨酸激酶的表達(dá)和活化。由于SLAP和C-SRC的SH2結(jié)構(gòu)域具有高同源性,SLAP可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合與C-SRC相關(guān)的生長(zhǎng)因子受體和有絲分裂信號(hào)通路受體。本研究的目的是研究SRC樣受體蛋白(SLAP)通過(guò)抑制C-SRC蛋白的磷酸化活化,逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)在放療治療過(guò)程中獲得的放療抵抗能力的作用機(jī)制。研究方法:使用C-SRC抑制劑dasatinib處理A549,H1650,H460肺癌細(xì)胞系,并且使用6mv直線加速器對(duì)A549,H1650,H460細(xì)胞系和經(jīng)過(guò)dasatinib預(yù)處理的A549,H1650,H460細(xì)胞系進(jìn)行2Gy和2Gyx4(2Gy放療兩天一次連續(xù)四次)的放療,觀察各組細(xì)胞系的增殖和凋亡能力。通過(guò)慢病毒載體轉(zhuǎn)染A549,H1650,H460細(xì)胞系,在72小時(shí)后使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或者低表達(dá)ADAM12的A549,H1650,H460細(xì)胞系,并且在該細(xì)胞系穩(wěn)定傳代5代之后使用western blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞系表達(dá)的ADAM12蛋白的水平。使用6mv直線加速器對(duì)A549,H1650,H460細(xì)胞系和過(guò)表達(dá),低表達(dá)ADAM12的A549,H1650,H460細(xì)胞系進(jìn)行2Gy和2Gyx4的放療,放療結(jié)束后48小時(shí)后使用CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力,caspase3試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡狀況,Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞ADAM12,C-SRC蛋白的表達(dá)情況,Elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組p-AKT表達(dá)情況。之后使用慢病毒載體構(gòu)建SLAP過(guò)表達(dá)的A549,H1650,H460細(xì)胞系,進(jìn)行2Gy和2Gyx4的放療,使用CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力,caspase3試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡狀況,Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞ADAM12,C-SRC蛋白的表達(dá)情況,Elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組p-AKT表達(dá)情況。并且在過(guò)表達(dá)SLAP的A549,H1650,H460細(xì)胞系的基礎(chǔ)上再敲減SLAP進(jìn)行相關(guān)的挽救實(shí)驗(yàn)。將過(guò)表達(dá)后敲減掉SLAP的細(xì)胞系同陰性對(duì)照組和SLAP過(guò)表達(dá)組進(jìn)行2Gy和2Gyx4的放療,使用CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力,caspase3試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡狀況,Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞ADAM12,C-SRC蛋白的表達(dá)情況,Elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組p-AKT,pMTOR,Cleaved PARP1,CDK1,CD44表達(dá)情況,使用劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)試細(xì)胞遷徙能力,使用transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)試細(xì)胞侵襲能力。最后使用慢病毒在已經(jīng)過(guò)表達(dá)或敲減SLAP的A549,H1650,H460細(xì)胞系中分別過(guò)表達(dá)和敲減C-SRC和AKT,并分別檢測(cè)各組細(xì)胞系在接受2Gyx4的放療前后AKT,p-AKT,E-cadherin,Vimentin的表達(dá)情況,使用劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)試細(xì)胞遷徙能力,使用transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)試細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果:使用dasatinib處理過(guò)的A549,H1650,H460細(xì)胞系經(jīng)過(guò)2Gy放療后增殖能力明顯降低,凋亡明顯增加,但是經(jīng)過(guò)2Gyx4的放療后dasatinib失去了以上作用。經(jīng)過(guò)WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)2Gyx4的放療后的A549,H1650,H460細(xì)胞系A(chǔ)DAM12表達(dá)增高,敲減ADAM12后A549,H1650,H460細(xì)胞系在2Gyx4的放療后恢復(fù)了對(duì)dasatinib的藥物敏感性。構(gòu)建的過(guò)表達(dá)SLAP和過(guò)表達(dá)后敲減SLAP的A549,H1650,H460細(xì)胞系在經(jīng)過(guò)2Gyx4的放療后,在SLAP過(guò)表達(dá)組各個(gè)細(xì)胞系的ADAM12蛋白保持低表達(dá)狀態(tài),其增殖能力同對(duì)照組和過(guò)表達(dá)后敲減SLAP的各個(gè)細(xì)胞系組明顯降低,凋亡情況增加,并且p-C-SRC,p-AKT,CDK1,CD44表達(dá)降低,p-MTOR,Cleaved PARP1表達(dá)升高,其侵襲能力和遷移能力明顯減低。而過(guò)表達(dá)SLAP細(xì)胞系在敲減SLAP之后其生物學(xué)行為又回到了之前的水平。在各組穩(wěn)定過(guò)表達(dá)SLAP的細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)C-SRC和AKT導(dǎo)致其p-C-SRC和p-AKT上調(diào),并且增強(qiáng)了細(xì)胞的遷徙能力和侵襲能力。在各組敲減SLAP的細(xì)胞系中敲減C-SRC和AKT導(dǎo)致其p-C-SRC和p-AKT下調(diào),并且減弱了細(xì)胞的遷徙能力和侵襲能力。結(jié)論:C-SRC是治療非小細(xì)胞肺癌的重要靶基因,C-SRC抑制劑dasatinib聯(lián)合單劑量放療可以增加細(xì)胞的凋亡和減低細(xì)胞的增殖能力。而連續(xù)2Gy放療4次激活了肺癌細(xì)胞系中ADAM12蛋白的過(guò)表達(dá),而ADAM12蛋白有促進(jìn)上皮細(xì)胞間充質(zhì)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的能力,而EMT可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的放療和化療抵抗,并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷徙和侵襲。減低肺癌細(xì)胞系中ADAM12的表達(dá)可以增加腫瘤細(xì)胞在使用2Gyx4放療治療后對(duì)dasatinib的敏感性。過(guò)表達(dá)ADAM12蛋白則會(huì)逆轉(zhuǎn)以上在肺癌細(xì)胞系中的作用,證明ADAM12可以調(diào)控肺癌細(xì)胞對(duì)dasatinb的敏感性。SLAP蛋白的過(guò)表達(dá)可以負(fù)調(diào)控ADAM12蛋白的表達(dá),并且下調(diào)p-C-SRC的表達(dá),增加了肺癌細(xì)胞的凋亡,抑制了細(xì)胞的增殖。通過(guò)敲減SLAP將過(guò)表達(dá)SLAP的肺癌細(xì)胞系中SLAP蛋白水平回復(fù)到正常水平后,逆轉(zhuǎn)了SLAP蛋白在上訴細(xì)胞系的作用,證明SLAP可以負(fù)調(diào)控ADAM12和p-C-SRC的表達(dá)來(lái)調(diào)控肺癌細(xì)胞系的生物學(xué)功能。在過(guò)表達(dá)SLAP肺癌細(xì)胞系進(jìn)行2Gyx4放療前通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)的C-SRC和AKT蛋白使p-C-SRC和p-AKT蛋白水平升高,觀察到SLAP過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中獲得的放療敏感性和低水平的增殖,遷移,侵襲能力都發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。在低表達(dá)SLAP肺癌細(xì)胞系進(jìn)行2Gyx4放療前通過(guò)敲減的C-SRC和AKT蛋白使p-C-SRC和p-AKT蛋白水平降低,在SLAP低表達(dá)細(xì)胞系中獲得的放療抵抗和高水平的增殖,遷移,侵襲能力都發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。證明SLAP可以負(fù)調(diào)控CSRC蛋白的磷酸化,從而降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力,侵襲能力和遷徙能力。另一方面SLAP可以通過(guò)負(fù)調(diào)控ADAM12蛋白逆轉(zhuǎn)放療產(chǎn)生的放療抵抗和化療抵抗,為臨床上化療放療聯(lián)合治療提供新的思路。
【圖文】：

13圖 1. A549,H1650,H460 細(xì)胞系進(jìn)行 0Gy, 2Gy, 4Gy, 后 48h, C-SRC, P-C-SRC 的蛋白表達(dá)情況。3.2 C-SRC 抑制劑 dasatinib 可以有效抑制單次 2Gy 放療后 P-C-SRC 的表達(dá)，，但對(duì) 2Gy將消化下來(lái)的 A549，H1650, H460 細(xì)胞系細(xì)胞板中，分別作為對(duì)照組，dasatinib 組，放療 2Gy 和dasatinib 組，于處理 48 小時(shí)后檢測(cè) C-SRC,P-SRC 的A549, H1650, H460 細(xì)胞系在經(jīng)過(guò) 2Gy 和 2Gyx4 的

H1650, H460 細(xì)胞系在經(jīng)過(guò) 2Gy 和 2Gyx4ADAM12 蛋白的表達(dá)情況。3.4 ADAM12 蛋白參與了 2Gyx4 放療后肺癌生使用慢病毒載體分別構(gòu)建過(guò)表達(dá)和敲減 ADAM胞系如圖 4A 所示 A549, H1650, H460 細(xì)胞系在ADAM12 蛋白后分別測(cè)定各個(gè)細(xì)胞系中 ADAM12細(xì)胞系在敲除 ADAM12 基因和過(guò)表達(dá) ADAM12
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R734.2;R730.55

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本文編號(hào)：2690744