【摘要】：念珠菌病感染是癌癥、糖尿病、艾滋病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等危重病患者的并發(fā)癥之一,其體內(nèi)深部感染問題已經(jīng)日益突出,成為危害病人死亡的重要病因。白色念珠菌(Candida albicans)通常存在于人的口腔、上呼吸道及陰道黏膜等部位。正常情況下,它與人體皮膚、粘膜表面的其它菌類達到平衡,不引起疾病。當真菌之間制衡失調(diào)時,白色念珠菌改變自身形態(tài)并大量繁殖,引起機體感染白色念珠菌。病人被白色念珠菌侵染初期癥狀不明顯且不具有特異性,缺乏早期診斷的指標,往往錯過最佳的治療時間而導致死亡率上升,所以實現(xiàn)白色念珠菌感染的早期診斷至關(guān)重要。實驗室常用的診斷方法有血培養(yǎng)法、組織病理性檢查、直接鏡檢法等。目前血培養(yǎng)法被認為是臨床上診斷的金標準,但它敏感性差、耗時長,往往延誤最佳的治療時機。組織病理性檢查為創(chuàng)傷性檢查,危重病患者難以承受。血清學檢測法具有快速、簡便、縮短檢出時間的優(yōu)勢,彌補血培養(yǎng)法的不足,同時該方法還具有良好的靈敏性和不需要昂貴儀器的優(yōu)點,是常用的實驗室診斷方法。尋找理想的抗原標志物,可以達到提高血清學檢測靈敏度的效果。目前作為診斷指標的抗原有甘露聚糖、烯醇化酶、(1,3)-β-D-葡聚糖、果糖二磷酸醛縮酶、熱休克蛋白90等,篩選理想的診斷標志物對于提高白色念珠菌的診斷水平至關(guān)重要。本研究選用了兩種診斷標志物果糖二磷酸醛縮酶1(Fba1)和熱休克蛋白90(Hsp90)。Fba1出現(xiàn)在念珠菌細胞壁與胞漿內(nèi),在白色念珠菌呈菌絲相生長時,含量明顯上調(diào),說明Fba1與白色念珠菌侵襲生長相關(guān),被認為是菌絲相特異性蛋白。Hsp90主要分布在胞漿,當機體被白色念珠菌感染時,Hsp90可以增加白色念珠菌的耐藥性,調(diào)節(jié)白色念珠菌形態(tài)的變化、蛋白質(zhì)的合成等,誘導細胞免疫反應。本文基于實驗室前期的白色念珠菌檢測研究基礎(chǔ),將噬菌體展示技術(shù)和血清檢測學聯(lián)合應用,旨在提高白色念珠菌檢測的靈敏度。本研究主要包括以下2方面內(nèi)容:1.白色念珠菌感染的診斷方法研究:選擇兩種免疫優(yōu)勢抗原Fba1和Hsp90,制備血清學檢測試劑分別是Fba1重組蛋白(rFba1),在fd噬菌體pVIII端展示Fba1表位的單展示噬菌體F-phage,在fd噬菌體pIII端展示Hsp90表位的單展示噬菌體phage-H,同時在fd噬菌體pIII端和pVIII端展示Fba1表位和Hsp90表位的雙展示噬菌體F-phage-H。2.檢測試劑的抗原性鑒定:Fba1重組蛋白、F-phage、phage-H兩種單展示噬菌體和F-phage-H雙展示噬菌體均具有較好的抗原性,可以用于血清學檢測。3.癌癥患者的血清學診斷研究:利用上述制備的檢測試劑對癌癥患者血清進行間接ELISA檢測,Fba1重組蛋白的陽性檢出率略高于單展示噬菌體F-phage和phage-H,雙展示噬菌體F-phage-H的陽性檢出率最高,顯著高于Fba1重組蛋白,可以通過聯(lián)合展示檢測標志物的方法提高噬菌體檢測的靈敏度。本研究的意義:白色念珠菌感染臨床上的早期特征不具有特異性,發(fā)現(xiàn)時可能會耽誤最佳治療時機。因此實現(xiàn)白色念珠菌感染的早期診斷對提高病人的治愈率和延長病人生命有重要的意義。血清學診斷是實驗室常用的診斷方法,選擇合適的標志物對血清學診斷效率的提高至關(guān)重要。目前,臨床上尚無針對白色念珠菌檢測的確定標志物。本研究聯(lián)合噬菌體展示技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法,縮短檢出時間提高診斷的靈敏性,為實現(xiàn)臨床上白色念珠菌感染的早期檢測奠定一定的基礎(chǔ),減少癌癥患者白色念珠菌感染的致死率。
【圖文】：

菌侵襲相關(guān)的蛋白，，可引起機體免疫反應[45, 46]。Mitsutake等白在念珠菌感染病人中的診斷價值[47]。二磷酸醛縮酶 （1fructose-diphosphate aldolase，F(xiàn)ba1）分子量約的關(guān)鍵酶[48]。念珠菌的代謝過程中 Fba1 起到關(guān)鍵的作用。白時，F(xiàn)ba1 含量增加，說明它與白色念珠菌侵襲性生長相關(guān)[4抗原，可引發(fā)機體產(chǎn)生免疫反應[51]。究選用了兩種與白色念珠菌侵襲相關(guān)的蛋白，果糖二磷酸和熱休克蛋白 90（Hsp90）。菌體展示技術(shù)絲狀噬菌體噬菌體包括 M13、f1、fd phage 等，本研究選用的是 fd 噬菌體生物材料，寬 7nm、長 900nm，含有 5 種外殼蛋白[52]。pV背部，有 2700 個拷貝，展示的外殼蛋白數(shù)量不受限制。pII只能展示 5 個外殼蛋白，特異性強。

4圖 2 多肽片段展示在 pIII 端的單展示噬菌體模式圖2.3.2 pVIII 展示系統(tǒng)pVIII 是 fd 噬菌體的主要外殼蛋白，位于其背部，拷貝數(shù)目較多有。不能展示過大的多肽或蛋白，但展示數(shù)目不受限制。有輔助噬菌體參與時，可形成雜合噬菌體，此時可融合較長的多肽片段。特點：展示的拷貝多，抗原性好。圖 3 多肽片段展示在 pVIII 端的單展示噬菌體模式圖表 1 絲狀噬菌體 pIII 展示系統(tǒng)與 pVIII 展示系統(tǒng)分析比較2.3.3 雙展示系統(tǒng)同時在fd噬菌體的pIII和pVIII端展示不同的外源多肽，構(gòu)建雙展示噬菌體。圖 4 兩種不同外源多肽同時展示在 pIII 端和 pVIII 端的雙展示噬菌體模式圖
【學位授予單位】：東北師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R446.1;R519.3

【參考文獻】

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1 馬春芳;陸靜芬;孔倩倩;韓丹丹;廖紅;李芳秋;;念珠菌優(yōu)勢抗體檢測方法的建立及臨床診斷價值評估[J];醫(yī)學研究生學報;2013年11期

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4 黃曉軍;血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標準與治療原則(草案)[J];中華內(nèi)科雜志;2005年07期

本文編號：2687000