【摘要】：念珠菌病感染是癌癥、糖尿病、艾滋病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等危重病患者的并發(fā)癥之一,其體內(nèi)深部感染問(wèn)題已經(jīng)日益突出,成為危害病人死亡的重要病因。白色念珠菌(Candida albicans)通常存在于人的口腔、上呼吸道及陰道黏膜等部位。正常情況下,它與人體皮膚、粘膜表面的其它菌類(lèi)達(dá)到平衡,不引起疾病。當(dāng)真菌之間制衡失調(diào)時(shí),白色念珠菌改變自身形態(tài)并大量繁殖,引起機(jī)體感染白色念珠菌。病人被白色念珠菌侵染初期癥狀不明顯且不具有特異性,缺乏早期診斷的指標(biāo),往往錯(cuò)過(guò)最佳的治療時(shí)間而導(dǎo)致死亡率上升,所以實(shí)現(xiàn)白色念珠菌感染的早期診斷至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)室常用的診斷方法有血培養(yǎng)法、組織病理性檢查、直接鏡檢法等。目前血培養(yǎng)法被認(rèn)為是臨床上診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但它敏感性差、耗時(shí)長(zhǎng),往往延誤最佳的治療時(shí)機(jī)。組織病理性檢查為創(chuàng)傷性檢查,危重病患者難以承受。血清學(xué)檢測(cè)法具有快速、簡(jiǎn)便、縮短檢出時(shí)間的優(yōu)勢(shì),彌補(bǔ)血培養(yǎng)法的不足,同時(shí)該方法還具有良好的靈敏性和不需要昂貴儀器的優(yōu)點(diǎn),是常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。尋找理想的抗原標(biāo)志物,可以達(dá)到提高血清學(xué)檢測(cè)靈敏度的效果。目前作為診斷指標(biāo)的抗原有甘露聚糖、烯醇化酶、(1,3)-β-D-葡聚糖、果糖二磷酸醛縮酶、熱休克蛋白90等,篩選理想的診斷標(biāo)志物對(duì)于提高白色念珠菌的診斷水平至關(guān)重要。本研究選用了兩種診斷標(biāo)志物果糖二磷酸醛縮酶1(Fba1)和熱休克蛋白90(Hsp90)。Fba1出現(xiàn)在念珠菌細(xì)胞壁與胞漿內(nèi),在白色念珠菌呈菌絲相生長(zhǎng)時(shí),含量明顯上調(diào),說(shuō)明Fba1與白色念珠菌侵襲生長(zhǎng)相關(guān),被認(rèn)為是菌絲相特異性蛋白。Hsp90主要分布在胞漿,當(dāng)機(jī)體被白色念珠菌感染時(shí),Hsp90可以增加白色念珠菌的耐藥性,調(diào)節(jié)白色念珠菌形態(tài)的變化、蛋白質(zhì)的合成等,誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)。本文基于實(shí)驗(yàn)室前期的白色念珠菌檢測(cè)研究基礎(chǔ),將噬菌體展示技術(shù)和血清檢測(cè)學(xué)聯(lián)合應(yīng)用,旨在提高白色念珠菌檢測(cè)的靈敏度。本研究主要包括以下2方面內(nèi)容:1.白色念珠菌感染的診斷方法研究:選擇兩種免疫優(yōu)勢(shì)抗原Fba1和Hsp90,制備血清學(xué)檢測(cè)試劑分別是Fba1重組蛋白(rFba1),在fd噬菌體pVIII端展示Fba1表位的單展示噬菌體F-phage,在fd噬菌體pIII端展示Hsp90表位的單展示噬菌體phage-H,同時(shí)在fd噬菌體pIII端和pVIII端展示Fba1表位和Hsp90表位的雙展示噬菌體F-phage-H。2.檢測(cè)試劑的抗原性鑒定:Fba1重組蛋白、F-phage、phage-H兩種單展示噬菌體和F-phage-H雙展示噬菌體均具有較好的抗原性,可以用于血清學(xué)檢測(cè)。3.癌癥患者的血清學(xué)診斷研究:利用上述制備的檢測(cè)試劑對(duì)癌癥患者血清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè),Fba1重組蛋白的陽(yáng)性檢出率略高于單展示噬菌體F-phage和phage-H,雙展示噬菌體F-phage-H的陽(yáng)性檢出率最高,顯著高于Fba1重組蛋白,可以通過(guò)聯(lián)合展示檢測(cè)標(biāo)志物的方法提高噬菌體檢測(cè)的靈敏度。本研究的意義:白色念珠菌感染臨床上的早期特征不具有特異性,發(fā)現(xiàn)時(shí)可能會(huì)耽誤最佳治療時(shí)機(jī)。因此實(shí)現(xiàn)白色念珠菌感染的早期診斷對(duì)提高病人的治愈率和延長(zhǎng)病人生命有重要的意義。血清學(xué)診斷是實(shí)驗(yàn)室常用的診斷方法,選擇合適的標(biāo)志物對(duì)血清學(xué)診斷效率的提高至關(guān)重要。目前,臨床上尚無(wú)針對(duì)白色念珠菌檢測(cè)的確定標(biāo)志物。本研究聯(lián)合噬菌體展示技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)方法,縮短檢出時(shí)間提高診斷的靈敏性,為實(shí)現(xiàn)臨床上白色念珠菌感染的早期檢測(cè)奠定一定的基礎(chǔ),減少癌癥患者白色念珠菌感染的致死率。
【圖文】：

菌侵襲相關(guān)的蛋白，，可引起機(jī)體免疫反應(yīng)[45, 46]。Mitsutake等白在念珠菌感染病人中的診斷價(jià)值[47]。二磷酸醛縮酶 （1fructose-diphosphate aldolase，F(xiàn)ba1）分子量約的關(guān)鍵酶[48]。念珠菌的代謝過(guò)程中 Fba1 起到關(guān)鍵的作用。白時(shí)，F(xiàn)ba1 含量增加，說(shuō)明它與白色念珠菌侵襲性生長(zhǎng)相關(guān)[4抗原，可引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)[51]。究選用了兩種與白色念珠菌侵襲相關(guān)的蛋白，果糖二磷酸和熱休克蛋白 90（Hsp90）。菌體展示技術(shù)絲狀噬菌體噬菌體包括 M13、f1、fd phage 等，本研究選用的是 fd 噬菌體生物材料，寬 7nm、長(zhǎng) 900nm，含有 5 種外殼蛋白[52]。pV背部，有 2700 個(gè)拷貝，展示的外殼蛋白數(shù)量不受限制。pII只能展示 5 個(gè)外殼蛋白，特異性強(qiáng)。

4圖 2 多肽片段展示在 pIII 端的單展示噬菌體模式圖2.3.2 pVIII 展示系統(tǒng)pVIII 是 fd 噬菌體的主要外殼蛋白，位于其背部，拷貝數(shù)目較多有。不能展示過(guò)大的多肽或蛋白，但展示數(shù)目不受限制。有輔助噬菌體參與時(shí)，可形成雜合噬菌體，此時(shí)可融合較長(zhǎng)的多肽片段。特點(diǎn)：展示的拷貝多，抗原性好。圖 3 多肽片段展示在 pVIII 端的單展示噬菌體模式圖表 1 絲狀噬菌體 pIII 展示系統(tǒng)與 pVIII 展示系統(tǒng)分析比較2.3.3 雙展示系統(tǒng)同時(shí)在fd噬菌體的pIII和pVIII端展示不同的外源多肽，構(gòu)建雙展示噬菌體。圖 4 兩種不同外源多肽同時(shí)展示在 pIII 端和 pVIII 端的雙展示噬菌體模式圖
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R446.1;R519.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 馬春芳;陸靜芬;孔倩倩;韓丹丹;廖紅;李芳秋;;念珠菌優(yōu)勢(shì)抗體檢測(cè)方法的建立及臨床診斷價(jià)值評(píng)估[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2013年11期

2 孔小祥;李芳秋;王仕欽;史利寧;;用動(dòng)物模型評(píng)估抗烯醇化酶抗體測(cè)定對(duì)系統(tǒng)性白念珠菌病的診斷價(jià)值[J];臨床檢驗(yàn)雜志;2011年01期

3 吳宇芳;關(guān)曉東;;狼瘡性腎炎并發(fā)醫(yī)院感染的易感因素和細(xì)菌學(xué)分析[J];醫(yī)師進(jìn)修雜志;2005年23期

4 黃曉軍;血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則(草案)[J];中華內(nèi)科雜志;2005年07期

本文編號(hào)：2687000