發(fā)布時間：2020-05-29 08:51

【摘要】：目的:癌癥是環(huán)境因素、遺傳因素等多因素共同作用下引起細胞異常增殖所致,其分子學基礎是DNA突變導致基因表達調控體系的失衡。腫瘤的治療方法除三大傳統(tǒng)療法:手術、化療和放療之外,包括基因治療和免疫治療在內的生物治療等治療方法也正在迅速發(fā)展中。因為單一治療方法難以有效延長中晚期腫瘤患者生存期,因此多種治療方法聯(lián)合治療是臨床醫(yī)生常用的治療方案。食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一。我國食管癌的發(fā)病率和死亡率均居世界首位,每年約20多萬人死于食管癌。食管癌發(fā)病機制較復雜,且多種調控因子共同參與細胞癌變。對于臨床分期較早的患者,根治性手術是首選的治療方法。但部分患者確診時已到中晚期,或者一些高齡老年患者已無法耐受手術治療,而基因治療和免疫治療為聯(lián)合放化療提供了可行性的選擇方案。近年來,隨著分子生物學研究的不斷進展,基因治療已逐漸應用至臨床治療中。基因治療成功與否極大程度上取決于治療基因能否被有效傳遞,因此,基因治療需要有效的載體。目前比較成熟的病毒載體主要有腺病毒、皰疹病毒、逆轉錄病毒及痘苗病毒等,均已被廣泛地應用于基因治療的動物或臨床研究中。因腺病毒載體具有只表達目的基因且不產(chǎn)生病毒、安全性高等優(yōu)點,故本研究中采用腺病毒作為目的基因的載體。人白細胞介素-29(interleukin-29,IL-29)基因位于19號染色體長臂(19q13.13),其mRNA全長856 bp,其開放閱讀框為603 bp,它是IL-10細胞因子超家族的一員。IL-29的生物學功能主要有抗病毒、抗增殖以及免疫調節(jié)等。但鑒于細胞因子在臨床應用的弊端,即細胞因子分子量較小和作用半衰期短等應用限制性,本研究旨在對IL-29基因通過分子克隆技術進行重組,構建攜帶IL-29基因的5型腺病毒載體(pAd5-IL-29),制備重組腺病毒(Ad5-IL-29),并探究Ad5-IL-29在食管癌細胞系介導的抗增殖作用及其初步機制。本研究將為Ad5-IL-29介導的食管癌基因治療的臨床前研究提供實驗基礎和理論依據(jù)。方法:1 pAd5-IL-29的構建:根據(jù)IL-29基因可被誘導表達,用干擾素誘導劑poly I:C刺激HaCaT細胞,經(jīng)RT-PCR方法擴增目的基因即IL-29基因片段,純化回收PCR產(chǎn)物。將IL-29基因片段與pCR2.1質粒載體連接,連接產(chǎn)物經(jīng)Nhe I酶和Hind III酶雙酶切鑒定及基因測序。用Kpn I酶和Not I酶依次酶切pCR2.1-IL-29得到的IL-29基因片段,將其構建入經(jīng)同種酶切的穿梭載體pShuttle2中,轉化擴增后提取質粒pShuttle2-IL-29。用Hinc II酶和Nco I酶分別酶切pShuttle2-IL-29進行酶切鑒定。用I-Ceu I酶和PI-Sce I酶雙酶切質粒pShuttle2-LacZ、pShuttle2-IL-29和pAd5,質粒pShuttle2-LacZ和pShuttle2-IL-29的酶切產(chǎn)物分別與pAd5的酶切產(chǎn)物連接,Swa I酶分別消化連接產(chǎn)物,轉化擴增后分別提取質粒pAd5-LacZ和pAd5-IL-29。Hind III酶酶切pAd5-LacZ和pAd5-IL-29進行酶切鑒定。2 pAd5-IL-29轉染293細胞及Ad5-IL-29的制備:攜帶有編碼LacZ和IL-29基因序列的腺病毒載體分別經(jīng)Pac I酶酶切后,用脂質體法分別轉染到包裝細胞人腎上皮細胞系293細胞中,待病理性細胞死亡效應出現(xiàn)后,提取病毒即分別攜帶有編碼LacZ和IL-29基因序列的重組腺病毒Ad5-LacZ和Ad5-IL-29,共三次感染293細胞后,即大量擴增病毒至需要量。用Adeno-X~(TM) virus purification kits(BD Biosciences,Clontech)純化Ad5-LacZ和Ad5-IL-29,50%組織培養(yǎng)感染劑量法(tissue culture infective dose,TCID_(50))測定病毒滴度。用KARBER公式計算病毒滴度:T=10~(1+d(s-0.5))。3 Western Blot方法鑒定IL-29的表達:將對照組Ad5-LacZ和實驗組Ad5-IL-29以MOI=3000感染食管癌細胞YES2,收集上清,煮沸變性后,經(jīng)SDS-PAGE后轉膜,5%脫脂奶粉封閉,單克隆抗體anti-hIL-29(RD Systems)及相應二抗孵育后ECL顯影。4細胞增殖率檢測:對照組Ad5-LacZ與實驗組Ad5-IL-29分別以不同的感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為0、30、100、300、1000和3000感染不同的食管癌細胞TE1、TE2、TE10、YES2、YES5和YES6,每個樣本3個重復實驗,用酶標儀于450 nm波長處讀取OD值。根據(jù)測定的OD值,計算細胞增殖率。5流式細胞儀檢測細胞周期改變:對照組Ad5-LacZ與實驗組Ad5-I L-29分別以MOI=3000感染食管癌細胞YES2,每個樣本3個重復實驗,于培養(yǎng)后24 h和48 h,經(jīng)碘化丙啶染色,用流式細胞儀分析細胞周期改變情況。6應用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析,對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗,數(shù)據(jù)資料用均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示,方差齊的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差不齊的數(shù)據(jù)則采用非參數(shù)檢驗,需要進一步比較的數(shù)據(jù)組以最小顯著差法(Student-Newman-Keuls,SNK)作兩兩比較,每組實驗不少于3個獨立的重復樣本,P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果:1 pAd5-LacZ和pAd5-IL-29的構建克隆IL-29基因并構建質粒pCR2.1-IL-29,經(jīng)測序鑒定,IL-29基因序列與GenBank公布的基因序列一致(IL-29:AY129150);經(jīng)Kpn I酶和Not I酶依次酶切pCR2.1-IL-29得到IL-29基因片段,并將其亞克隆入經(jīng)同種酶酶切的穿梭載體pShuttle2中。I-Ceu I酶和PI-Sce I酶雙酶切質粒pShuttle2-LacZ、pShuttle2-IL-29和pAd5,pShuttle2-IL-29和pShuttle2-LacZ的酶切產(chǎn)物分別與pAd5的酶切產(chǎn)物連接,構建了pAd5-LacZ和pAd5-IL-29。2 Ad5-LacZ和Ad5-IL-29的制備及IL-29的表達鑒定通過脂質體法將pAd5-LacZ和pAd5-IL-29分別轉染入293細胞中,共三次感染293細胞后,擴增、提取及純化了Ad5-LacZ和Ad5-IL-29,分別進行了滴度測定。Western Blot結果顯示對照組沒有相應的條帶出現(xiàn),而實驗組中檢測到分子量約23 kDa的特異蛋白條帶,提示pAd5-IL-29構建成功,且IL-29可在Ad5-IL-29感染的食管癌細胞株YES2中表達。3 Ad5-IL-29介導的抗增殖作用機制的初步研究3.1 Ad5-IL-29抑制不同食管癌細胞增殖的情況與Ad5-LacZ處理組相比,隨著MOI的增高,Ad5-IL-29處理組中各細胞的增殖率均不同程度下降,而在TE1、TE10和YES6細胞中增殖率的變化差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),在TE2、YES2和YES5細胞中增殖率的變化差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。在抑制細胞增殖方面,與Ad5-LacZ相比,Ad5-IL-29可抑制TE2、YES2和YES5細胞增殖,但在TE1、TE10和YES6細胞中未發(fā)現(xiàn)其抑制細胞增殖的作用。3.2 Ad5-IL-29對YES2細胞的細胞周期影響情況用流式細胞儀檢測敏感細胞株YES2中細胞周期改變情況,結果顯示,處理YES2細胞48 h后,實驗組Ad5-IL-29與對照組Ad5-LacZ相比,sub-G1期和S期比例均出現(xiàn)不同程度增高(P0.05)。結論:1可構建pAd5-IL-29,IL-29可在Ad5-IL-29感染的食管癌細胞株YES2中表達。2 Ad5-IL-29可抑制食管癌細胞增殖,但不同食管癌細胞株對其介導的抗增殖作用敏感性不同。在對其抗增殖作用敏感的食管癌細胞株中,其抗增殖作用的機制可能是細胞凋亡和細胞周期S期阻滯。
【圖文】：

RT-PCR擴增IL-29基因片段電泳圖

pCR2.1-IL-29載體的構建及酶切鑒定Fig.2ConstructionofpCR2.1-IL-29andidentificationwithenzymedigestion
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R735.1;R450

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 徐剛;劉實;朱應;;Ⅲ型干擾素最新研究進展[J];中國科學:生命科學;2015年02期

2 胡奇嬋;陳s，

本文編號：2686691