【摘要】：目的:癌癥是環(huán)境因素、遺傳因素等多因素共同作用下引起細(xì)胞異常增殖所致,其分子學(xué)基礎(chǔ)是DNA突變導(dǎo)致基因表達(dá)調(diào)控體系的失衡。腫瘤的治療方法除三大傳統(tǒng)療法:手術(shù)、化療和放療之外,包括基因治療和免疫治療在內(nèi)的生物治療等治療方法也正在迅速發(fā)展中。因?yàn)閱我恢委煼椒y以有效延長(zhǎng)中晚期腫瘤患者生存期,因此多種治療方法聯(lián)合治療是臨床醫(yī)生常用的治療方案。食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一。我國食管癌的發(fā)病率和死亡率均居世界首位,每年約20多萬人死于食管癌。食管癌發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜,且多種調(diào)控因子共同參與細(xì)胞癌變。對(duì)于臨床分期較早的患者,根治性手術(shù)是首選的治療方法。但部分患者確診時(shí)已到中晚期,或者一些高齡老年患者已無法耐受手術(shù)治療,而基因治療和免疫治療為聯(lián)合放化療提供了可行性的選擇方案。近年來,隨著分子生物學(xué)研究的不斷進(jìn)展,基因治療已逐漸應(yīng)用至臨床治療中�；蛑委煶晒εc否極大程度上取決于治療基因能否被有效傳遞,因此,基因治療需要有效的載體。目前比較成熟的病毒載體主要有腺病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒及痘苗病毒等,均已被廣泛地應(yīng)用于基因治療的動(dòng)物或臨床研究中。因腺病毒載體具有只表達(dá)目的基因且不產(chǎn)生病毒、安全性高等優(yōu)點(diǎn),故本研究中采用腺病毒作為目的基因的載體。人白細(xì)胞介素-29(interleukin-29,IL-29)基因位于19號(hào)染色體長(zhǎng)臂(19q13.13),其mRNA全長(zhǎng)856 bp,其開放閱讀框?yàn)?03 bp,它是IL-10細(xì)胞因子超家族的一員。IL-29的生物學(xué)功能主要有抗病毒、抗增殖以及免疫調(diào)節(jié)等。但鑒于細(xì)胞因子在臨床應(yīng)用的弊端,即細(xì)胞因子分子量較小和作用半衰期短等應(yīng)用限制性,本研究旨在對(duì)IL-29基因通過分子克隆技術(shù)進(jìn)行重組,構(gòu)建攜帶IL-29基因的5型腺病毒載體(pAd5-IL-29),制備重組腺病毒(Ad5-IL-29),并探究Ad5-IL-29在食管癌細(xì)胞系介導(dǎo)的抗增殖作用及其初步機(jī)制。本研究將為Ad5-IL-29介導(dǎo)的食管癌基因治療的臨床前研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。方法:1 pAd5-IL-29的構(gòu)建:根據(jù)IL-29基因可被誘導(dǎo)表達(dá),用干擾素誘導(dǎo)劑poly I:C刺激HaCaT細(xì)胞,經(jīng)RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因即IL-29基因片段,純化回收PCR產(chǎn)物。將IL-29基因片段與pCR2.1質(zhì)粒載體連接,連接產(chǎn)物經(jīng)Nhe I酶和Hind III酶雙酶切鑒定及基因測(cè)序。用Kpn I酶和Not I酶依次酶切pCR2.1-IL-29得到的IL-29基因片段,將其構(gòu)建入經(jīng)同種酶切的穿梭載體pShuttle2中,轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后提取質(zhì)粒pShuttle2-IL-29。用Hinc II酶和Nco I酶分別酶切pShuttle2-IL-29進(jìn)行酶切鑒定。用I-Ceu I酶和PI-Sce I酶雙酶切質(zhì)粒pShuttle2-LacZ、pShuttle2-IL-29和pAd5,質(zhì)粒pShuttle2-LacZ和pShuttle2-IL-29的酶切產(chǎn)物分別與pAd5的酶切產(chǎn)物連接,Swa I酶分別消化連接產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后分別提取質(zhì)粒pAd5-LacZ和pAd5-IL-29。Hind III酶酶切pAd5-LacZ和pAd5-IL-29進(jìn)行酶切鑒定。2 pAd5-IL-29轉(zhuǎn)染293細(xì)胞及Ad5-IL-29的制備:攜帶有編碼LacZ和IL-29基因序列的腺病毒載體分別經(jīng)Pac I酶酶切后,用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞人腎上皮細(xì)胞系293細(xì)胞中,待病理性細(xì)胞死亡效應(yīng)出現(xiàn)后,提取病毒即分別攜帶有編碼LacZ和IL-29基因序列的重組腺病毒Ad5-LacZ和Ad5-IL-29,共三次感染293細(xì)胞后,即大量擴(kuò)增病毒至需要量。用Adeno-X~(TM) virus purification kits(BD Biosciences,Clontech)純化Ad5-LacZ和Ad5-IL-29,50%組織培養(yǎng)感染劑量法(tissue culture infective dose,TCID_(50))測(cè)定病毒滴度。用KARBER公式計(jì)算病毒滴度:T=10~(1+d(s-0.5))。3 Western Blot方法鑒定IL-29的表達(dá):將對(duì)照組Ad5-LacZ和實(shí)驗(yàn)組Ad5-IL-29以MOI=3000感染食管癌細(xì)胞YES2,收集上清,煮沸變性后,經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉,單克隆抗體anti-hIL-29(RD Systems)及相應(yīng)二抗孵育后ECL顯影。4細(xì)胞增殖率檢測(cè):對(duì)照組Ad5-LacZ與實(shí)驗(yàn)組Ad5-IL-29分別以不同的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為0、30、100、300、1000和3000感染不同的食管癌細(xì)胞TE1、TE2、TE10、YES2、YES5和YES6,每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn),用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處讀取OD值。根據(jù)測(cè)定的OD值,計(jì)算細(xì)胞增殖率。5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期改變:對(duì)照組Ad5-LacZ與實(shí)驗(yàn)組Ad5-I L-29分別以MOI=3000感染食管癌細(xì)胞YES2,每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn),于培養(yǎng)后24 h和48 h,經(jīng)碘化丙啶染色,用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期改變情況。6應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),數(shù)據(jù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,方差齊的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差不齊的數(shù)據(jù)則采用非參數(shù)檢驗(yàn),需要進(jìn)一步比較的數(shù)據(jù)組以最小顯著差法(Student-Newman-Keuls,SNK)作兩兩比較,每組實(shí)驗(yàn)不少于3個(gè)獨(dú)立的重復(fù)樣本,P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1 pAd5-LacZ和pAd5-IL-29的構(gòu)建克隆IL-29基因并構(gòu)建質(zhì)粒pCR2.1-IL-29,經(jīng)測(cè)序鑒定,IL-29基因序列與GenBank公布的基因序列一致(IL-29:AY129150);經(jīng)Kpn I酶和Not I酶依次酶切pCR2.1-IL-29得到IL-29基因片段,并將其亞克隆入經(jīng)同種酶酶切的穿梭載體pShuttle2中。I-Ceu I酶和PI-Sce I酶雙酶切質(zhì)粒pShuttle2-LacZ、pShuttle2-IL-29和pAd5,pShuttle2-IL-29和pShuttle2-LacZ的酶切產(chǎn)物分別與pAd5的酶切產(chǎn)物連接,構(gòu)建了pAd5-LacZ和pAd5-IL-29。2 Ad5-LacZ和Ad5-IL-29的制備及IL-29的表達(dá)鑒定通過脂質(zhì)體法將pAd5-LacZ和pAd5-IL-29分別轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中,共三次感染293細(xì)胞后,擴(kuò)增、提取及純化了Ad5-LacZ和Ad5-IL-29,分別進(jìn)行了滴度測(cè)定。Western Blot結(jié)果顯示對(duì)照組沒有相應(yīng)的條帶出現(xiàn),而實(shí)驗(yàn)組中檢測(cè)到分子量約23 kDa的特異蛋白條帶,提示pAd5-IL-29構(gòu)建成功,且IL-29可在Ad5-IL-29感染的食管癌細(xì)胞株YES2中表達(dá)。3 Ad5-IL-29介導(dǎo)的抗增殖作用機(jī)制的初步研究3.1 Ad5-IL-29抑制不同食管癌細(xì)胞增殖的情況與Ad5-LacZ處理組相比,隨著MOI的增高,Ad5-IL-29處理組中各細(xì)胞的增殖率均不同程度下降,而在TE1、TE10和YES6細(xì)胞中增殖率的變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),在TE2、YES2和YES5細(xì)胞中增殖率的變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在抑制細(xì)胞增殖方面,與Ad5-LacZ相比,Ad5-IL-29可抑制TE2、YES2和YES5細(xì)胞增殖,但在TE1、TE10和YES6細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)其抑制細(xì)胞增殖的作用。3.2 Ad5-IL-29對(duì)YES2細(xì)胞的細(xì)胞周期影響情況用流式細(xì)胞儀檢測(cè)敏感細(xì)胞株YES2中細(xì)胞周期改變情況,結(jié)果顯示,處理YES2細(xì)胞48 h后,實(shí)驗(yàn)組Ad5-IL-29與對(duì)照組Ad5-LacZ相比,sub-G1期和S期比例均出現(xiàn)不同程度增高(P0.05)。結(jié)論:1可構(gòu)建pAd5-IL-29,IL-29可在Ad5-IL-29感染的食管癌細(xì)胞株YES2中表達(dá)。2 Ad5-IL-29可抑制食管癌細(xì)胞增殖,但不同食管癌細(xì)胞株對(duì)其介導(dǎo)的抗增殖作用敏感性不同。在對(duì)其抗增殖作用敏感的食管癌細(xì)胞株中,其抗增殖作用的機(jī)制可能是細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期S期阻滯。
【圖文】：

RT-PCR擴(kuò)增IL-29基因片段電泳圖

pCR2.1-IL-29載體的構(gòu)建及酶切鑒定Fig.2ConstructionofpCR2.1-IL-29andidentificationwithenzymedigestion
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R735.1;R450

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 徐剛;劉實(shí);朱應(yīng);;Ⅲ型干擾素最新研究進(jìn)展[J];中國科學(xué):生命科學(xué);2015年02期

2 胡奇嬋;陳s，

本文編號(hào)：2686691