【摘要】：第一部分武漢協(xié)和醫(yī)院肺部感染來源產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌分子流行病學特征目的了解來源于肺部感染病人產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌分離株ESBLs基因流行情況,確定其基因亞型,基因背景及菌株特征,探討產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細菌在我院肺部感染病人分布情況、耐藥及傳播機制,為臨床醫(yī)師用藥及院內(nèi)感染的控制提供依據(jù)。方法收集2015年11月-2016年6月來自華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科確證產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌及肺炎克雷伯桿菌分離菌株263株,剔除不合格標本,最終符合要求的菌株59株。用血瓊脂培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng),以藥敏紙片法確證ESBL表型,以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法及測序檢測CTX-M、SHV、TEM基因,PCR產(chǎn)物進行測序并確定其基因亞型,同時測定ESBL基因上游序列;以細菌基因組重復(fù)序列(Rep-PCR)、多位點序列分型(MLST)法檢測細菌間的同源性。結(jié)果本院肺部感染產(chǎn)ESBLs大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌檢出率達22.43%,產(chǎn)ESBLs菌對三代、四代頭孢、氨曲南、喹諾酮類抗生素耐藥率高于60%,對阿米卡星、亞胺培南、美羅培南敏感率高于90%。在59份標本中,分離出31株大腸埃希氏菌,其中20株CTX-M基因陽性(占64.51%,分別為CTX-M-3、-14、-27),17株SHV基因陽性(54.84%,分別為SHV-12、-28、-77、81),3株TEM基因陽性(占9.68%,分別為TEM-1),1株菌同時攜帶SHV-77、-81,1株含有CTX-M、SHV、TEM三種基因陽性(3.23%)。在分離的28株肺炎克雷伯菌中,21株CTX-M基因陽性(占75.00%,分別為CTX-M-3、-14、-27、-65),23株SHV基因陽性(82.14%,分別為SHV-1、-2、-11、-12、-28、-77、-78、-119),16株TEM基因陽性(57.14%,分別為TEM-1、-104、-135);其中7株同時CTX-M、SHV、TEM三種基因陽性(25.00%)。MLST分型結(jié)果顯示致病力、強耐藥性及傳播力強的的超級細菌ST131型大腸桿菌以及高毒力、攜帶多種耐藥質(zhì)粒高致病性的ST11型肺炎克雷伯桿菌在我院肺部感染患者中流行,值得我們高度警惕。此外還檢測出4株耐碳青霉烯抗生素的肺炎克雷伯桿菌,均攜帶有NDM型基因。上游調(diào)控序列檢測發(fā)現(xiàn),CTX-M型基因上游序列ISEcp1、SHV型基因上游序列IS26參與ESBL傳播及促進酶的表達。結(jié)論1)我院肺部感染產(chǎn)ESBLs大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌檢出率高,以呼吸機相關(guān)性肺炎占主要,主要集中在外科、重癥醫(yī)學科。2)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌總體耐藥率高,特別是對三、四代頭孢、氨曲南、喹諾酮類抗生素耐藥率高,雖存在耐碳青霉烯抗生素肺炎克雷伯桿菌,但總體對碳青霉烯類抗生素敏感。此外,對阿米卡星、哌拉西林他唑巴坦敏感度高,可作為替代或者聯(lián)合用藥。3)CTX-M型是我院產(chǎn)ESBLs菌株主要類型,其中以CTX-M-14占比最高。大腸桿菌以CTX-M型為主,肺炎克雷伯桿菌以SHV基因型為主。多基因攜帶情況多見。4)致病力、強耐藥性及傳播力強的的超級細菌ST131型大腸桿菌以及高毒力、攜帶多種耐藥質(zhì)粒高致病性的ST11型肺炎克雷伯桿菌在我院肺部感染患者中流行,值得我們高度警惕。5)本實驗只發(fā)現(xiàn)有肺炎克雷伯桿菌同時攜帶產(chǎn)碳青霉烯酶和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因,其攜帶的碳青霉烯酶基因包括NDM基因。6)ISEcp1和IS26分別作為CTX-M型、SHV型ESBLs基因上游序列,參與了CTX-M型、SHV型傳播,且參與了促進了耐藥基因的表達,是ESBL廣泛流行的重要原因。第二部分武漢協(xié)和醫(yī)院泛耐藥銅綠假單胞菌分子流行病學特征目的:調(diào)查研究我院泛耐藥銅綠假單胞菌流行情況及耐藥機制。方法:收集2016.1-2017.6武漢協(xié)和醫(yī)院僅對多粘菌素敏感的泛耐藥銅綠假單胞菌菌株,REP-PCR及MLST分析菌株同源性關(guān)系。PCR擴增檢測產(chǎn)碳青霉烯酶基因、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因、氨基糖苷鈍化酶基因以及喹諾酮類耐藥基因。結(jié)果:總共分離得到非重復(fù)816株銅綠假單胞菌,其中僅對多粘菌素敏感的菌株7株。經(jīng)過MLST分型,7株菌共發(fā)現(xiàn)有6種類型,其中有兩株同屬于一個類型,ST274。兩株為新類型,即ST2546、ST3001。耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn),7株銅綠假單胞菌均含有多種耐藥基因。結(jié)論:1、我院僅對多粘菌素敏感的泛耐藥銅綠假單胞菌檢出率低于全國水平。從科室分布來看,內(nèi)科系統(tǒng)檢出率高于外科系統(tǒng),其中以呼吸科、重癥醫(yī)學科為主。從標本類型來看,痰、膽汁明顯多于血、尿標本。僅對多粘菌素敏感的泛耐藥銅綠假單胞菌引起肺部感染、膽系特別是對有膽管支架植入術(shù)感染在我院仍不容樂觀。2、從已有的數(shù)據(jù)來看,僅對多粘菌素敏感的泛耐藥銅綠假單胞菌均有多基因攜帶情況,其中喹諾酮類耐藥基因兼具染色體和質(zhì)粒介導(dǎo)的多種類型,機制頗為復(fù)雜。3、ST274型銅綠假單胞菌在我院已經(jīng)存在水平傳播,該型銅綠假單胞菌易于形成突變系,再加上泛耐藥的特性,給我們控制該菌株引起的感染帶來了極大的挑戰(zhàn)。第三部分產(chǎn)ESBLs細菌異質(zhì)性耐藥機制初步研究目的既往對于細菌的研究都是基于群體而忽視了個體間的差異,而實際上經(jīng)過抗生素篩選后,單克隆來源的細菌間總有一小部分生存下來,這一小部分細菌在耐藥性方面與其他有顯著不同,本研究在第一部分的基礎(chǔ)上,擬研究以單個細菌為對象,初步探究這種耐藥性差異機制,為深入了解細菌在抗生素壓力環(huán)境下的生存機制提供基礎(chǔ)。方法前期已構(gòu)建好含綠色熒光蛋白(GFP)與β-內(nèi)酰胺酶基因的表達載體,在熒光顯微鏡下檢測β內(nèi)酰胺酶調(diào)控序列介導(dǎo)下GFP在單個細胞中的表達情況。通過流式分選分選經(jīng)過過夜培養(yǎng)后的高低表達GFP的兩組細菌,然后在流式分選及檢測下分析高低亞群單克隆細胞間耐藥水平的差異。同時檢測藥敏值差異。結(jié)果高低表達亞群細菌流式檢測分析有明顯差異,高表達組的細菌熒光強度高,細菌結(jié)構(gòu)更復(fù)雜,生長速率更慢,耐藥性高。低熒光蛋白表達亞群熒光強度低,生長速率快,耐藥性低。結(jié)論1、單克隆來源的大腸埃希菌菌株間存在耐藥水平的顯著差異2、這種耐藥水平的差異可能于某種物質(zhì)調(diào)控細菌生長速率有關(guān)。
【圖文】：

圖 1 59 列標本 CAP、HAP、VAP 分布比例科肺炎痰、血標本產(chǎn) ESBLs 檢出率表 7 各病區(qū)產(chǎn) ESBLs 菌株檢出情況大腸埃希菌和肺炎 產(chǎn) ESBLs 的大腸埃希菌 克雷伯桿菌菌株數(shù) 肺炎克雷伯桿菌菌株 30 15 12 9 11 3 科 10 8 10 4 6 3 4 4 4 3 4 1 3 2 3 2 3 2

華 中 科 技 大 學 碩 士 學 位 論 文阿米卡星、頭孢吡肟、左氧氟沙星、頭孢唑林、頭孢他啶、阿莫西林克拉維酸、拉西林他唑巴坦無耐藥菌株出現(xiàn)，敏感率 100%；對復(fù)方新諾明、慶大霉素、環(huán)丙星敏感率相同，為97.4%；對氨芐西林舒巴坦、氯霉素、哌拉西林敏感率分別為95.90.9%、89.7%；氨芐西林敏感率最低，，為 10.5%。四、59 株產(chǎn) ESBLs 大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌基因分型1、59 株菌的 PCR 擴增結(jié)果使用 CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、CTX-M-25、SHV、TEM 共 7 對 ESB引物對 59 株產(chǎn) ESBLs 菌株 DNA 進行 PCR 擴增，擴增產(chǎn)物片段大小與預(yù)期相符。果如圖 2、3。CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-25 組未擴增出產(chǎn)物。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R563.1;R446.5

【參考文獻】

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本文編號：2684553