【摘要】：腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)一種由免疫細(xì)胞分泌出來(lái)的炎癥因子,用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。臨床研究表明TNF-α的高水平表達(dá)與炎癥反應(yīng)、心血管疾病、自身免疫性疾病等相關(guān)。TNF-α是重要的生物標(biāo)志物,已作為某些疾病預(yù)后、臨床治療的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。納米抗體(Nanobody,Nb)是通過(guò)克隆駝源抗體中的重鏈可變區(qū)基因而獲得一種基因工程抗體,是已知最小的抗體,分子量為15 KD。研究表明納米抗體具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好,易表達(dá)等優(yōu)點(diǎn),可用于檢測(cè)、治療等領(lǐng)域。電化學(xué)免疫傳感器是通過(guò)將抗原抗體反應(yīng)的生物信號(hào)用電信號(hào)的形式加以放大,從而實(shí)現(xiàn)高靈敏性檢測(cè),已被廣泛用于腫瘤標(biāo)志物、毒素等的檢測(cè)。本研究采用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了抗TNF-α納米抗體噬菌體展示文庫(kù)。通過(guò)3輪生物親和淘選的方法得到37株陽(yáng)性噬菌體克隆,利用基因工程技術(shù)將其中三個(gè)抗TNF-α納米抗體(NbA26、NbB5、NbC13)在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試實(shí)驗(yàn)鑒定后,結(jié)果顯示納米抗體NbB5具有更好性能,將其作為制備電化學(xué)免疫傳感器的元件,通過(guò)構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)TNF-α的高靈敏檢測(cè)。主要研究結(jié)果如下:1.用TNF-α抗原對(duì)羊駝采取多點(diǎn)免疫,三次免疫結(jié)束后采集了50 mL駝外周淋巴血,分離白細(xì)胞,提取得到了總RNA。經(jīng)巢式PCR、酶切、電轉(zhuǎn)化等系列實(shí)驗(yàn),獲得庫(kù)容為1.2×10~8的抗TNF-α納米抗體噬菌體展示文庫(kù),目的基因插入的正確率為100%,經(jīng)輔助噬菌體M13KO7救援后,噬菌體文庫(kù)滴度為3.2×10~(13) cfu/mL。2.通過(guò)三輪噬菌體文庫(kù)淘選,并用phage-ELISA方法對(duì)噬菌體克隆進(jìn)行了鑒定。從文庫(kù)中挑選出了150個(gè)克隆,篩選到37株陽(yáng)性抗TNF-α納米抗體噬菌體,編號(hào)為A1、A4、A7、A13、A15、A22、A24、A25、A26、A28、B4、B5、B6、B7、B8、B13、B14、B17、B18、B32、B41、B50、C1、C4、C5、C9、C13、C16、C24、C27、C28、C29、C30、C31、C32、C33、C34。測(cè)序后進(jìn)行比對(duì)分析,共獲得了20種納米抗體序列。3.提取了編號(hào)為A26、B5、C13的噬菌粒,使用Sfi I、Not I酶切,得到VHH目的片段后重組至pET25b中。分別構(gòu)建了pET25b-NbA26、pET25b-NbB5、pET25b-NbC13重組載體,且成功轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta中,成功實(shí)現(xiàn)納米抗體NbB5、NbA26、NbC13的表達(dá)。ELISA進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明納米抗體NbB5親和力最高,特異性更好,選擇NbB5作為后續(xù)構(gòu)建免疫傳感器的檢測(cè)元件。4.通過(guò)MPA法將單克隆抗體固定于金電極作為捕獲抗體,TNF-α被捕獲后,NbB5作為檢測(cè)抗體,并利用HRP酶進(jìn)行信號(hào)放大,成功構(gòu)建了雙抗夾心模式的電化學(xué)免疫傳感器。用該傳感器檢測(cè)血清中的TNF-α,其最低檢測(cè)限為8 pg/mL,檢測(cè)范圍為0.01~5 ng/mL。通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)分析準(zhǔn)確性,加標(biāo)回收率為90.05~123.33%,變異系數(shù)為13.51~15.05%。
【圖文】：

圖 2.1 噬菌體文庫(kù)構(gòu)建方法示意圖Fig 2.1 Outline of strategies to construct the phage display library.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

圖 2.2 血清中抗體效價(jià)的測(cè)定Figure 2.2 Measurement of antibody titers in serum2.3.2 淋巴細(xì)胞和總 RNA 的提取TNF-α 抗原免疫羊駝三次后采血分離淋巴細(xì)胞，用 Trizol 等試劑提取其總
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R446.6;TP212

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本文編號(hào)：2682234