發(fā)布時(shí)間：2020-05-25 00:01

【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性、長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼的RNA分子,參與了各種生命過(guò)程中基因表達(dá)的調(diào)控。特別是在惡性腫瘤中,miRNA的表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn),血液以及其他體液中也存在豐富而穩(wěn)定的miRNAs。在腫瘤等病理狀態(tài)下,體液中的mi RNAs表達(dá)譜與在組織細(xì)胞中一樣,會(huì)發(fā)生特征性的改變。這些特定的miRNAs表達(dá)譜可構(gòu)成腫瘤等疾病的“指紋”,成為一種新的無(wú)創(chuàng)傷性診斷標(biāo)志物以助于疾病的預(yù)測(cè)、診斷和預(yù)后。目的:本研究以miRNA let-7d為目標(biāo)物,通過(guò)結(jié)合基于雙環(huán)發(fā)夾探針(DHP)的雙鏈特異性核酸酶信號(hào)放大(DSNSA)策略和阿霉素功能化的金納米粒子(AuNPs@Dox)復(fù)合材料信號(hào)放大的優(yōu)點(diǎn),構(gòu)建一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的miRNA電化學(xué)生物傳感器。方法:1.電化學(xué)生物傳感器的制備:聯(lián)合基于雙環(huán)發(fā)夾探針的雙鏈特異性核酸酶信號(hào)放大策略和阿霉素功能化的金納米粒子復(fù)合材料的信號(hào)放大,構(gòu)建用于超靈敏檢測(cè)mi RNA的電化學(xué)生物傳感器。用電化學(xué)阻抗譜法(EIS)、循環(huán)伏安法(CV)、透射電鏡(TEM)、Zeta分析電位法、紫外可見(jiàn)吸收光譜法、熒光分光光度法、瓊脂糖凝膠電泳等方法對(duì)傳感器的每一步構(gòu)建進(jìn)行表征。2.電化學(xué)生物傳感器的可行性驗(yàn)證和實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化:對(duì)傳感器的可行性進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)AuNPs與Dox的體積比,MCH的濃度,捕獲探針(Cp)與信號(hào)鏈1(S1)的雜交時(shí)間,DSN的反應(yīng)時(shí)間、濃度和反應(yīng)溫度進(jìn)行探索和優(yōu)化。3.化學(xué)生物傳感器的性能評(píng)估:在最優(yōu)條件下,對(duì)傳感器的線(xiàn)性范圍、靈敏度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、特異性和回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析評(píng)估。結(jié)果:1.瓊脂糖凝膠電泳、熒光分光光度法驗(yàn)證基于雙環(huán)發(fā)夾探針的雙鏈特異性核酸酶信號(hào)放大策略的實(shí)現(xiàn)。透射電鏡、紫外可見(jiàn)吸收光譜法和Zeta分析電位法表征AuNPs@Dox納米復(fù)合材料的成功合成。電化學(xué)阻抗法和循環(huán)伏安法表征探針在電極上的修飾、雜交反應(yīng)以及鏈置換反應(yīng)的順利進(jìn)行。2.在優(yōu)化條件下,對(duì)不同濃度的目標(biāo)物miRNA let-7d進(jìn)行檢測(cè),利用方波伏安法(SWV)分析電化學(xué)信號(hào)。在1 p M-10 nM范圍內(nèi)電化學(xué)信號(hào)與目標(biāo)物濃度的對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性相關(guān),R~2=0.993,計(jì)算得到最低檢測(cè)限為0.17 pM(S/N=3)。3.制備好的傳感器在4℃保存兩周后,檢測(cè)信號(hào)可以保持初始信號(hào)的92.6%。用同批次的miRNA傳感器對(duì)不同濃度的目標(biāo)物(10 pM、50 pM和200 pM)分別重復(fù)檢測(cè)3次,得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是4.55%、4.31%和5.03%。不同濃度的回收率為92.95 109.84%。結(jié)論:設(shè)計(jì)的多功能、無(wú)標(biāo)記的DHP在DSNSA系統(tǒng)中表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性、穩(wěn)定性以及對(duì)DSN的耐受性。該電化學(xué)生物傳感器結(jié)合DSNSA策略和AuNPs@Dox復(fù)合材料信號(hào)放大的優(yōu)點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了基于目標(biāo)物的雙重信號(hào)放大,提高了檢測(cè)的靈敏度,實(shí)現(xiàn)了對(duì)miRNA的超靈敏、特異的檢測(cè)。同時(shí)本研究中采用的新型發(fā)夾探針以及先進(jìn)的納米生物復(fù)合材料,在核酸檢測(cè)以及生物傳感器構(gòu)建等方面具有很高的應(yīng)用前景。
【圖文】：

徊糠鄭嘌喙δ�、无睍覊q乃鄕販⒓刑秸耄 HP）的設(shè)計(jì)如圖1A 所示，其包含三個(gè)區(qū)域：與目標(biāo) miRNA 識(shí)別序列，輸出片段（Op）及其互補(bǔ)序列片段。DHP 中三個(gè)區(qū)域的詳細(xì)堿基情況如表 1 所示�；� DHP 的雙鏈特異性核酸酶信號(hào)放大（DSNSA）的原理如圖 1B 所示。當(dāng)目標(biāo) miRNA 存在的情況下，miRNA 與 DHP 雜交，使 DHP 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)形成剛性雙螺旋螺旋結(jié)構(gòu)。在 DSN的參與下，DHP 中的目標(biāo)識(shí)別序列被水解，，而 miRNA 和 Op 片段被釋放。然后釋放的 miRNA 可以與新的 DHP 重新雜交引發(fā)下一個(gè)循環(huán)，同時(shí)大量積累的 Op 片段可以參與后續(xù)的反應(yīng)。反之

1:3，v/v）活化 Au 電極表面 10 min，再用超純水清洗干凈。最后，安法（CV）在 0.1 M 的硫酸溶液中反復(fù)掃描（-0.2 V~1.6 V）Au 電極，定重復(fù)的 CV 曲線(xiàn)出現(xiàn)，取出 Au 電極用超純水清洗干凈后烘干待用。2 金電極的修飾如圖 2B 所示，為了使探針更好的固定在 Au 電極表面，首先把 10 μL 的 H 滴加在預(yù)處理好的 Au 電極表面上，在室溫下放置 1 h，然后用超純水反再將 10 μL 1 mΜ 修飾有巰基的捕獲探針（Capture probe，Cp）滴在 Au面上，并在4℃下孵育12 h使Cp穩(wěn)定地固定在電極表面，然后用緩沖液（2-HCl）清洗去除多余的 Cp。接著，在避光的情況下，將 10 μLAuNPs@Dox到 Au 電極上，并在 37℃下放置 2 h，使 S1 與 Cp 充分雜交，然后用緩沖除去未雜交的 AuNPs@Dox@S1。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R446

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;日本開(kāi)發(fā)出制造合金納米粒子新方法[J];中國(guó)粉體工業(yè);2017年04期

2 劉競(jìng)文;關(guān)樺楠;韓博林;;金納米粒子模擬過(guò)氧化物酶的初步研討[J];農(nóng)產(chǎn)品加工;2018年11期

3 韋克毅;王猛;杜宇;蔡波;江云寶;;基于手性金納米粒子圓二色光譜法識(shí)別與檢測(cè)銀離子[J];廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2016年04期

4 李軍朋;周駿;姜濤;劉雁婷;;海膽狀金納米粒子表面形貌對(duì)表面增強(qiáng)喇曼散射特性的影響（英文）[J];光子學(xué)報(bào);2015年04期

5 吳少玨;汪昌炎;羅忠;陳思妤;阮金竹;趙彥利;;副產(chǎn)物誘導(dǎo)的超級(jí)金納米粒子的原位合成（英文）[J];Science China Materials;2015年11期

6 ;美研究顯示:黃金納米粒子或可用于抗癌治療[J];祝您健康;2017年09期

7 楊輔龍;董守安;王曉娜;方衛(wèi);戴云生;;葡萄糖溶液中金納米粒子的光化學(xué)合成及其光譜性質(zhì)研究[J];貴金屬;2012年02期

8 胡芳;孟衛(wèi);張燕;張玲艷;王險(xiǎn)峰;;金銀合金納米粒子的制備[J];五邑大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2011年01期

9 錢(qián)章生;劉玫瑰;田大慧;郝丹;朱昌青;;基于發(fā)光金納米粒子熒光增強(qiáng)法測(cè)定溶菌酶[J];分析化學(xué);2011年05期

10 楊志先;;美找到無(wú)公害生產(chǎn)金納米粒子的方法[J];功能材料信息;2010年Z1期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 謝超;任吉存;;共振散射相關(guān)光譜表征金納米粒子的粒徑和粒徑分布[A];第十屆中國(guó)化學(xué)會(huì)分析化學(xué)年會(huì)暨第十屆全國(guó)原子光譜學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

2 李春梅;桑幼;李原芳;;熒光增強(qiáng)及金納米粒子色度法測(cè)定凝血酶[A];第十屆中國(guó)化學(xué)會(huì)分析化學(xué)年會(huì)暨第十屆全國(guó)原子光譜學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

3 柏祥濤;李欣偉;鄭利強(qiáng);;手性離子液體修飾的金納米粒子的合成及自組裝[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第27屆學(xué)術(shù)年會(huì)第13分會(huì)場(chǎng)摘要集[C];2010年

4 李麗美;方萍萍;楊志林;黃文達(dá);吳德印;任斌;田中群;;球形金納米粒子耦合體系的FDTD模擬[A];第十五屆全國(guó)光散射學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

5 沈星燦;蔣凌風(fēng);程蕾;梁宏;;金納米粒子熒光增強(qiáng)及其在痕量分析中的應(yīng)用[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第二十五屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集（下冊(cè)）[C];2006年

6 焦玉芬;王晶;陳朗星;何錫文;尹洪宗;;不同形貌的金納米粒子的光散射和表面增強(qiáng)拉曼光譜的研究[A];2008年中國(guó)機(jī)械工程學(xué)會(huì)年會(huì)暨甘肅省學(xué)術(shù)年會(huì)文集[C];2008年

7 張文思;蘇志強(qiáng);;多肽嵌段序列實(shí)現(xiàn)金納米粒子原位生長(zhǎng)及自組裝[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)2017全國(guó)高分子學(xué)術(shù)論文報(bào)告會(huì)摘要集——主題J：高分子組裝與超分子體系[C];2017年

8 李敏;張成孝;漆紅蘭;;基于金納米粒子負(fù)載信號(hào)物質(zhì)的電化學(xué)發(fā)光多肽傳感器的研究[A];第十三屆全國(guó)光化學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2013年

9 李美婷;趙環(huán)宇;呂中元;;基于金納米粒子的多功能載藥材料的制備及應(yīng)用[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第30屆學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集-第三十八分會(huì)：納米生物效應(yīng)與納米藥物化學(xué)[C];2016年

10 郭軼;沈娜;李慧;張德辰;郝翠婷;徐力;;肽修飾金納米粒子用于納米酶研究[A];第九屆中國(guó)酶工程學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2013年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 羅曄;韓國(guó)闡明合金納米粒子的催化劑反應(yīng)機(jī)理[N];中國(guó)有色金屬報(bào);2018年

2 記者 田學(xué)科;美找到控制金納米粒子大小新方法[N];科技日?qǐng)?bào);2012年

3 聞風(fēng);以研制出新型呼吸檢測(cè)器[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2009年

4 記者 張忠霞;金納米粒子做成遙控“藥丸”[N];新華每日電訊;2009年

5 毛黎;美利用DNA鏈獲得金納米粒子晶體[N];科技日?qǐng)?bào);2008年

6 鄭煥斌;金納米粒子可大幅加速析氫過(guò)程[N];科技日?qǐng)?bào);2012年

7 記者 張家偉;黃金納米粒子有助提高癌癥化療效果[N];科技日?qǐng)?bào);2015年

8 記者 張巍巍;黃金納米粒子可在腦部腫瘤“安家”[N];科技日?qǐng)?bào);2012年

9 記者 毛黎;美制成金納米粒子和蛋白質(zhì)復(fù)合結(jié)構(gòu)[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

10 本報(bào)駐美國(guó)記者 毛黎;桂皮幫你淘“金�！盵N];科技日?qǐng)?bào);2010年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 趙雪利;二維、三維功能性納米組裝體與生物分子及細(xì)胞相互作用機(jī)制研究[D];江南大學(xué);2018年

2 王翠;二氧化硅穩(wěn)定的金納米粒子尺寸可控合成與性能研究[D];大連理工大學(xué);2017年

3 陳靖禹;新型聚苯胺微/納米結(jié)構(gòu)的合成及性能研究[D];吉林大學(xué);2007年

4 郭軼;利用賴(lài)氨酸和賴(lài)氨酸肽修飾和組裝金納米粒子[D];吉林大學(xué);2007年

5 白杰;有機(jī)/無(wú)機(jī)復(fù)合納米材料的制備及其在有機(jī)反應(yīng)中的應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2008年

6 王純榮;軟物質(zhì)團(tuán)簇制備金納米粒子的可調(diào)控軟模板作用研究[D];江南大學(xué);2007年

7 李晶;枝狀金納米粒子/聚合物復(fù)合結(jié)構(gòu)構(gòu)筑及腫瘤細(xì)胞光熱治療研究[D];吉林大學(xué);2016年

8 周軍;自組裝二維金納米粒子陣列的后處理：退火，操控及應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2015年

9 湯劍鋒;貴金屬基合金納米粒子微觀結(jié)構(gòu)特征的原子模擬[D];湖南大學(xué);2016年

10 李艾橘;聚合物接枝金納米粒子及微米膠體粒子的研究[D];吉林大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 陶一一;聯(lián)合雙環(huán)發(fā)夾探針和阿霉素功能化的金納米粒子用于MicroRNA的電化學(xué)檢測(cè)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

2 謝曉娜;聚合物/金納米粒子復(fù)合納米膠束自組裝行為的耗散粒子動(dòng)力學(xué)模擬[D];華南理工大學(xué);2018年

3 王亞平;近紅外發(fā)光金納米粒子的光學(xué)性能調(diào)控及腫瘤成像研究[D];華南理工大學(xué);2018年

4 曾帥;花狀金納米粒子的快速合成及其表面增強(qiáng)拉曼光譜的研究[D];華中師范大學(xué);2018年

5 郜捷;基于小分子連接DNA末端保護(hù)結(jié)合銀納米簇和金納米粒子的蛋白質(zhì)分析[D];河北大學(xué);2018年

6 倪駿鵬;硅片上自組裝金納米粒子二維陣列的制備及交聯(lián)研究[D];東北大學(xué);2015年

7 李琳琳;金納米粒子陣列的真空熱處理[D];東北大學(xué);2015年

8 任樂(lè);基于RGDC肽修飾的金納米粒子用于光熱療法治療胰腺癌的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

9 李宗兵;雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與金納米粒子結(jié)合新型生物傳感器的研制[D];江蘇師范大學(xué);2017年

10 王亞;有序介孔碳負(fù)載金納米催化劑對(duì)芳硝基化合物選擇加氫[D];上海師范大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2679206