【摘要】：目的:在人體中,更新快速的小腸組織細胞和造血干細胞對電離輻射(Irradiation,IR)最為敏感,而與造血系統(tǒng)相比,電離輻射誘發(fā)的小腸結(jié)構(gòu)與功能紊亂發(fā)生機制研究不夠深入,缺乏有效的防治手段。因此,尋找低毒、高效、方便服用的腸道電離輻射損傷防治藥物及闡明其相關(guān)機理一直是放射生物學(xué)領(lǐng)域熱門話題之一。本課題組前期工作篩選了多種香蘭素衍生物的電離輻射防護作用,發(fā)現(xiàn)丁香醛(VND3207)顯著提高細胞電離輻射抗性、抑制細胞凋亡。本論文主要從VND3207對放射性腸損傷的防護效果和防護機制展開討論。方法:(1)9 Gyγ射線全身照射6-8周齡C57BL/6J小鼠,照前0.5小時灌胃給予VND3207(100 mg/Kg)或溶劑對照,照射后記錄小鼠的生存狀態(tài),繪制生存和體重曲線;并在不同時間點取腸道制備病理學(xué)切片,通過HE染色觀察VND3207對小鼠腸道病理形態(tài)學(xué)的影響,同時,應(yīng)用TUNEL凋亡檢測試劑盒和cleaved caspase-3免疫組化染色檢測小鼠腸道隱窩細胞凋亡的情況,并用Ki67的免疫組化染色觀察小鼠隱窩的增殖情況。另外,使用人源的腸上皮細胞(HIEC-6)做體外實驗的驗證,CCK-8實驗檢測不同濃度的VND3207對HIEC-6細胞毒性;應(yīng)用EDU試劑盒檢測VND3207對受照后細胞的增殖影響;明確VND3207對放射性腸損傷的防護效果。(2)應(yīng)用基因表達譜芯片篩選單純照射組和VND3207聯(lián)合照射組之間的差異表達基因,q RT-PCR對其中的一些差異表達基因Slc5a4a、Akr1c14、Maob、Nfkbia、Gadd45g和Pmaip1進行了驗證。篩選出VND3207靶向基因及其所在區(qū)域,對其進行簡要地分析,并使用免疫組化的方法探索VND3207對輻照后的小鼠腸道組織中Noxa相關(guān)信號分子的表達影響。(3)VND3207預(yù)處理C57BL/6J小鼠半個小時后,給予9 Gyγ射線進行全身照射,并在照后不同時間點取小腸組織,檢測照后3.5 d和7 d的小腸組織中的氧化應(yīng)激水平。并通過8-OHdG和γ-H2AX的組織免疫熒光染色觀察小腸隱窩細胞DNA的氧化損傷和雙鏈斷裂損傷;同時,在細胞水平上采用γ-H2AX的免疫熒光檢測DNA的損傷修復(fù);Western blot檢測VND3207對腸上皮細胞中的DNA-PKcs自磷酸化的影響;探討在腸道組織和細胞中,VND3207調(diào)控輻射誘發(fā)的DNA損傷及功能分子的修復(fù)機制。結(jié)果:(1)與單純照射組相比,VND3207顯著的改善小鼠的體重并明顯延長9Gyγ射線照射的C57BL/6J小鼠的存活時間,顯著提高其存活率,有效保護電離輻射引起的腸組織結(jié)構(gòu)損傷,在降低小腸隱窩細胞凋亡率的同時促進腸隱窩細胞的增殖。(2)小鼠腸道組織基因芯片分析發(fā)現(xiàn)VND3207可顯著調(diào)控多種基因的表達及信號通路,進而免疫組化分析結(jié)果顯示VND3207通過調(diào)控小鼠腸道組織中p53蛋白的磷酸化修飾,進而抑制Noxa蛋白表達,并緩解了輻射引起的凋亡。GO富集分析表明了VND3207參與維持腸道微生物的穩(wěn)態(tài),初步闡述VND3207對放射性腸損傷的防護機制。(3)通過檢測小鼠腸道組織的抗氧化活性和DNA損傷指標(biāo)揭示了VND3207可以降低腸道中的氧化應(yīng)激水平,緩解輻射誘發(fā)的DNA氧化損傷和DNA雙鏈斷裂損傷,在細胞水平上,同樣應(yīng)用免疫熒光染色標(biāo)記γ-H2AX和Western blot分析DNA-PKcs的自磷酸化水平,分析結(jié)果顯示,VND3207顯著抑制γ-H2AX的形成,以及促進DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵分子DNA-PKcs的自磷酸化。表明VND3207可能參與DNA的NHEJ修復(fù),對輻照后小鼠腸道組織的重建過程做出重要的貢獻。結(jié)論:本研究證實VND3207對放射性腸損傷的保護作用,緩解放射性腸損傷癥狀,揭示了VND3207對放射性腸損傷的防護機制可能有三個方面:一是參與調(diào)控小鼠腸道組織中p53磷酸化激活,抑制Noxa誘導(dǎo)的細胞凋亡;二是降低輻射引起的氧化應(yīng)激水平,從而抑制小鼠腸道組織的DNA氧化損傷和雙鏈斷裂損傷;三是可能通過參與調(diào)控DNA-PKcs的自磷酸化,促進受輻照損傷DNA的NHEJ修復(fù)。本研究為揭示放射性腸損傷發(fā)生、發(fā)展機制提供新的理論與實驗依據(jù)。
【圖文】：

第一部分 VND3207 對小鼠放射性腸損傷的防護作用及其機制研究分析結(jié)果顯示，如圖 1.1A 單純照射組的小鼠在第四天就開始逐漸死亡，至第13 天全部死亡，而 VND3207 聯(lián)合照射組的小鼠至第 10 天才開始出現(xiàn)死亡，觀察至第 30 天時仍有 40% 的小鼠存活，且數(shù)據(jù)分析結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）由此說明 VND3207 聯(lián)合照射組與單純照射組小鼠相比存活時間顯著延長；雖然在照射后初期各組小鼠的體重都相對減輕，但單純照射組小鼠的體重降低的較快，而 VND3207 聯(lián)合照射組小鼠體重在照后 15 天達到最低，隨后存活的小鼠體重開始逐漸的恢復(fù)（圖 1.1 B）。這表明 VND3207 可以改善照后小鼠的生活狀態(tài)和體重變化。

圖 1.2-1 VND3207 對輻照后小鼠腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響A. C57BL/6 小鼠被給予 9 Gyγ 射線的全身照射，照后 3.5 d 小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)圖；B. 小鼠絨毛長度和隱窩深度定量分析（**p < 0.01, ***p < 0.01, n = 6）。隱窩數(shù)目和深淺的變化與隱窩細胞的增殖情況密切相關(guān)，據(jù)研究表明，在小鼠腸道受照射后的 3.5 d，隱窩細胞增殖最為明顯，為此我們采用免疫組化染色分析 3.5 d 取樣的腸道組織中 Ki67 的表達情況，Ki67 標(biāo)記的是處于增殖周期中的細胞，該標(biāo)記陽性率越高，組織的增殖速度越快[5]。如圖 1.2-2 C，γ 射線照射前，對照組和 VND3207 組小鼠腸道隱窩處的 Ki67+細胞數(shù)無明顯差異。而照射后，單純照射組中的 Ki67+細胞數(shù)明顯減少，VND3207 聯(lián)合照射組中處于細胞周期所有活躍期的細胞數(shù)目顯著增多。通過對小鼠腸道橫切面每周的陽性隱窩數(shù)和 Ki67+細胞數(shù)進行計數(shù)統(tǒng)計分析(圖 1.2-2 D 和 E)，發(fā)現(xiàn) VND3207 聯(lián)合照射組中陽性隱窩數(shù)增至 105±9（單純照射組 61±4），Ki67+細胞數(shù)增至 30±1（單純照射組 16±1），兩者差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。由此結(jié)果說明，，VND3207 可以促進小鼠
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R730.55

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本文編號：2677010