【摘要】：膿毒癥(sepsis)是指機體對感染的反應失調而導致危及生命的器官功能障礙。盡管膿毒癥真實的發(fā)病率仍然是未知數(shù),保守的估計表明膿毒癥是全球范圍內患者死亡和危重疾病的一個主要病因。膿毒癥治療的花費巨大,2011年來自美國的數(shù)據(jù)表明,超過200億美元(美國醫(yī)院臨床費用的5.2%)。急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是膿毒癥發(fā)展過程中最常見的并發(fā)癥之一。AKI的發(fā)病率會隨膿毒癥的嚴重程度而增加,患者出現(xiàn)膿毒癥相關的急性腎損傷(sepsis associated acute kidney injury,SA-AKI)時病死率翻倍,明顯高于其他因素導致的AKI。SA-AKI以急性腎衰竭為特征,表現(xiàn)為血液過濾不充分,水、電解質調節(jié)及尿液產(chǎn)生障礙。由于SA-AKI發(fā)病機制尚未完全闡明,目前臨床對SA-AKI患者以對癥支持治療為主,因此探明SA-AKI的發(fā)病機制并以此為靶點進行藥物研發(fā)具有重要的理論價值和臨床意義。HMGB1是一種進化高度保守且廣泛存在的蛋白,其通常作為染色質的結構蛋白而與DNA相結合。在大多數(shù)類型的細胞中,HMGB1主要存在于細胞核內參與維持核小體的形態(tài)和DNA的復制。在細胞質中的HMGB1則作為一種DAMP 分子通過和 TLR2(Toll like receptor-2)、TLR4、RAGE 和 CXCR4(chemokine receptor 4)等的相互作用激活促炎信號通路。因此,細胞受到炎癥打擊時可使HMGB從胞核移位到胞漿并發(fā)揮抗炎作用。有研究表明乙酰化修飾促進了 HMGB1的核漿移位,并最終促進了 HMGB1的細胞外分布。提示通過對HMGB1的去乙酰化修飾可抑制它介導的炎癥反應。然而,HMGB1的去乙�；揎椛嫌螜C制尚不明確且HMGB1介導的炎癥反應是否參與了膿毒癥急性腎損傷的發(fā)生發(fā)展尚未見報道。腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cell,RTEC)是腎小管的主要細胞,它參與了腎小管的重吸收、分泌和排泄等功能。缺血、感染和毒物等刺激引起RTEC損傷是腎小管功能障礙的主要因素,它們加速了 AKI的發(fā)展。然而,RTEC在SA-AKI的具體發(fā)生機制尚不明確。己知沉默信息調節(jié)因子2相關酶(Sirtuins)是一類進化中高度保守的蛋白,由SIR基因編碼,屬于Ⅲ類組蛋白去乙�；�。SIRT1是酵母Sir2的哺乳動物直接同源體之一,是目前研究的最多的哺乳動物sirtuin家族成員。SIRT1在胚胎發(fā)育和骨骼肌的分化過程中扮演很重要的作用。根據(jù)具體的環(huán)境不同,SIRT1在細胞中扮演不同的作用。目前研究表明,SIRT1主要通過去乙�；揎椖承┙M蛋白和非組蛋白發(fā)揮作用。目前研究證實的SIRT1的非組蛋白底物有P53、NF-1κB、PGC-lα、FOXO、liver X receptor(LXR)、PARP、Ku70、HIF-la等。我們最近研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥后,小鼠腎臟組織和腎小管上皮細胞的SIRT1蛋白表達和活性下降加重SA-AKI,而SIRT1激活可以減輕SA-AKI。最近的研究也發(fā)現(xiàn)HMGB1也是SIRT1去乙酰化作用革靶蛋白,且SIRT1能夠去乙�；疕MGB1提高內毒素小鼠的生存率。這些結果提示SIRT1減輕SA-AKI的機制可能和SIRT1去乙酰化HMGB1有關。通過上述文獻的回顧,我們推測膿毒癥打擊導致腎小管上皮細胞的SIRT1蛋白表達和活性下降,HMGB1的核漿移位增加,HMGB1釋放到胞質增加,加重了膿毒癥后系統(tǒng)的炎癥反應。因此,我們擬構建SA-AKI相關的動物和細胞模型:1、觀察各處理組HMGB1的蛋白表達及核漿移位、各類炎癥指標的變化、腎臟功能及膿毒癥小鼠的生存時間;2、探討SIRT1激活去乙�；疕MGB1的具體機制。通過上述研究為臨床上SA-AKI的發(fā)病機制和治療提供新的思路。第一部分 HMGB1在膿毒癥小鼠血清和腎臟細胞中的表達和移位方法參照我們既往文獻,復制SA-AKI小鼠模型。根據(jù)CLP的作用時間不同分為111個觀察時間點:0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20h。應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清HMGB1 的蛋白水平。應用Western Blot檢測腎皮質細胞中HMGB1和SIRT1的蛋白表達,HMGB1 的核漿移位。采用免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)聯(lián)合Western Blot測定HMGB1的乙�；健８鶕�(jù)我們既往研究,腎小管上皮細胞在SA-AKI發(fā)生中具有重要的作用,因此,我們通過LPS刺激的人腎小管上皮細胞(human kidney 2 cell,HK-2)構建SA-AKI相關的細胞模型。根據(jù)LPS刺激的時間不同,分為對應的觀察點,檢測的指標和方法和動物模型。結果1.CLP誘導的膿毒癥小鼠血清HMGB1含量進行性升高,腎臟組織HMGB1含量進行性減少。2.CLP后腎臟細胞HMGB1核漿位移增多、乙�；缴�。第二部分干預SIRT1對HMGB1的蛋白表達、核漿移位和乙�；降挠绊懛椒◤椭泼つc套扎穿刺(CLP)誘導的膿毒癥小鼠模型及LPS刺激HK-2細胞模型。SIRT1的激動和抑制分別采用特異性的激動劑SRT1720和特異性抑制劑Ex527。動物買驗分為四組:假手術(sham組)、CLP+Vehicle組、CLP+SRT1720組和CLP+EX527組。根據(jù)我們既往研究,腎小管上皮細胞在SA-AKI發(fā)生中具有重要的作用,因此,我們通過LPS刺激的人腎小管上皮細胞(human kidney 2 cell,HK-2)構建SA-AKI相關的細胞模型。細胞實驗先后通過SIRT1化學激動劑和抑制劑,以及SIRT1的siRNA來證實。其中根據(jù)化學激動、抑制的處理條件不同分為對照組(Control)組、LPS+Vehicle組、LPS+SRT1720組和CLP+EX527組。針對SIRT1的干擾條件不同分別為con-siRNA組、con-siRNA+LPS組、SIRTlsiRNA組和 SIRT1siRNA+LPS組。通過Western Blot法檢測SIRT1和HMGB1的蛋白表達,免疫熒光法檢測HMGB1在細胞內的分布,免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)法驗證SIRT1和HMGB1的相互作用,使用特異性的賴氨酸位點抗體WestemBlot法探討SIRT1去乙�；疕MGB1的賴氨酸位點。結果1.激動SIRT1使CLP誘導膿毒癥小鼠腎臟HMGB1核漿位移減少,乙�；浇档�。SIRT1抑制則結果相反。2.細胞模型證實激動和抑制(下調)SIRT1的結果和動物實驗一致。3.SIRT1和HMGB1存在相互作用關系,SIRT1去乙酰化HMGB1的主要賴氨酸位點依次為K29,K28,K30。第三部分驗證SIRT1去乙�；疕MGB1對膿毒癥小鼠的炎癥反應、腎臟病理及整體生存的影響方法復制CLP誘導的膿毒癥小鼠模型,根據(jù)處理條件不同分為四組:sham組、CLP+Vehicle組、CLP+SRT1720組和CLP+EX527組。通過Western Blot法檢測腎臟組織TLR2、TLR4和RAGE受體的表達,ELISA法檢測血清促炎細胞因子TNF-α、IL-6、IL-lp的含量,常規(guī)方法檢測血清BUN和Cr含量,腎臟組織病理以及腎小管細胞的凋亡,觀察小鼠的生存時間和72h生存率。結果1.激動SIRT1去乙酰化HMGB1可以抑制膿毒癥小鼠的炎癥反應。2.激動SIRT1去乙�；疕MGB1可以使膿毒癥小鼠腎小管上皮細胞凋亡減少,腎功能改善,生存時間延長,生存率增加。結論1.SA-AKI相關的動物和細胞模型中HMGB1乙�；潭仍黾�,HMGB1核漿移位和細胞外分泌增加。2.SA-AKI相關的動物和細胞模型中,SIRT1激動可以下調HMGB1的乙酰化水平,核漿移位減少。3.SIRT1去乙酰化HMGB1的主要賴氨酸位點依次為K29,K28,K30。4.激動SIRT1能夠減輕CLP誘導膿毒癥小鼠的炎癥反應,抑制細胞凋亡,改善腎功能,增加小鼠整體生存時間。
【圖文】：

ｓｉｒｔｕｉｎ。ＳＩＲＴ１在胚胎發(fā)育［７３’７４１和骨骼肌的分化［７５］過程中扮演很重要的作用。在逡逑細胞中具有很多不同的作用，包括染色質的修飾、代謝途徑的表觀學遺傳、炎逡逑癥和應激反應等［７６１邋（圖２）。ＳＩＲＴ１通過結合一些組蛋白和非組蛋白底物發(fā)揮去逡逑乙酰化作用。ＳＩＲＴ１會優(yōu)先的去乙�；M蛋白的特定位點如Ｈ４Ｋ１６邋（ｌｙｓｉｎｅ邋１６邋ｏｆ逡逑ｈｉｓｔｏｎｅ邋４）、Ｈ３Ｋ９邋（ｌｙｓｉｎｅ邋９邋ｏｆ邋ｈｉｓｔｏｎｅ邋３）、Ｈ３Ｋ５６邋（ｌｙｓｉｎｅ邋５６邋ｏｆ邋ｈｉｓｔｏｎｅ邋３）邋［７７］逡逑和Ｈ１Ｋ１６邋（ｌｙｓｉｎｅ邋１６邋ｏｆ邋ｈｉｓｔｏｎｅ邋１）來促進異染色質形成和轉錄沉默［７８’７９］。ＳＩＲＴ１逡逑的非組蛋白底物包括且不限于：腫瘤抑制因子Ｐ５３、ＮＦ－ｋＢ、ＰＧＣ－ｌｃｔ、ＦＯＸＯ、逡逑ｌｉｖｅｒ邋Ｘ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋（ＬＸＲ）、ＰＡＲＰ、Ｋｕ７０、（ＨＩＦ）－ｌａ［６３’８０—８７］。逡逑ＥＢ－琴逡逑＿Ｌ／／邋｜、逡逑■ｓａ邋W邋Ｉ邋ｎｐ逡逑圖２：邋ＳＩＲＴ１在機體和疾病中的調控作用。激動ＳＩＲＴ１可以使組蛋白和非組蛋白底物去乙酰逡逑化增加來影響多種細胞進程。（Ｐｏｕｌｏｓｅ，邋Ｎ．邋ａｎｄ邋Ｒ．邋Ｒａｊｕ，，邋Ｓｉｒｔｕｉｎ邋ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ａｇｉｎｇ邋ａｎｄ邋ｉｎｊｕｒｙ．逡逑Ｂｉｏｃｈｉｍ邋Ｂｉｏｐｈｙｓ邋Ａｃｔａ，邋２０１５．邋１８５２（１１）：邋ｐ．邋２４４２－５５．）逡逑５逡逑

圖３：實驗設計的技術路線圖
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R459.7

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4 周U

本文編號：2671988