【摘要】：膿毒癥是由感染引起的宿主反應失調,會導致威脅生命的器官功能障礙綜合征,具有高發(fā)病率和死亡率,并且臨床診斷和治療非常困難。每年,由感染發(fā)展至膿毒癥的患者數量達到數百萬,死亡率為22%～55%。糖萼是細胞表面上的多糖-蛋白質復合物結構,主要由蛋白聚糖和糖胺聚糖組成,具有重要的生理功能,例如維持血管的通透性,傳遞機械力和調節(jié)微血管環(huán)境。研究表明,糖萼將在膿毒癥發(fā)病時率先損傷,從而增加內皮通透性,血漿蛋白將泄漏到間隙中,引起組織水腫,同時損害組織氧供應和營養(yǎng)供應。因此,開發(fā)有效保護糖萼的藥物對降低膿毒癥患者的死亡率具有重要意義。腸道也被稱為膿毒癥發(fā)展的“始動器官”,其感染是導致膿毒癥在機體內部迅速擴展的重要因素。腸道內有復雜的腸道內菌體環(huán)境,會釋放出各類毒素,如內毒素、熱原等。上述毒素在侵入血液循環(huán)系統之前,必須突破腸黏膜屏障,而糖萼作為腸黏膜屏障的重要組成,在膿毒癥腸道感染中受損嚴重。因此,保護腸道糖萼具有重要價值。肝素在膿毒癥治療中常用作高凝狀態(tài)的預防,也發(fā)現肝素對可導致糖萼破壞的乙酰肝素酶(Heparanase,HPA)有明顯的抑制作用。然而,肝素因其具有的強大的抗凝活性,治療膿毒癥時會有潛在的出血風險,因此,具有低抗凝活性,對糖萼層有良好保護作用的肝素衍生物的研究和開發(fā)具有重要的臨床應用價值。肝素葡糖醛酸N位脫硫酸乙�；阴；母嗡匮苌�(N-desulfated/acetylated heparin derivative,NDSAH)具有較低的抗凝活性,保持了肝素的骨架結構。本課題在細胞水平和膿毒癥小鼠模型上考察NDSAH對糖萼損傷相關因素,包括HPA,基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)以及炎癥因子的影響,以探討NDSAH通過抑制糖萼脫落,從而膿毒癥小鼠的作用。本研究取得的主要成果及結論有以下幾方面1.肝素衍生物NDSAH的制備及體外抗凝活性研究1.1肝素衍生物NDSAH的制備和結構確證利用強酸性陽離子樹脂將肝素鈉轉型為肝素酸,再以吡啶中和制得肝素吡啶鹽。隨后在含有甲醇-DMSO溶液中加熱脫去肝素糖鏈上的N-硫酸根,所得的產物再用乙酸酐進行乙�；@得目標產物。采用NMR進行結構檢測,確證其為肝素葡聚糖醛酸N位全乙�；嗡匮苌�,記為NDSAH。1.2羊血漿法測定肝素衍生物NDSAH的抗凝效價采用重鈣化羊血漿檢測法,以肝素鈉為標準品,檢測NDSAH抗凝效價,為32.1IU/mg,表明NDSAH在來日臨床中出血風險會較肝素大幅降低。2.肝素衍生物NDSAH對FIP膿毒癥小鼠模型的生存率影響采用腹腔注射糞便混懸液(Fecal pellets suspended in PBS,FIP)的方法制作膿毒癥小鼠模型,以肝素為對照,考察NDSAH對小鼠生存率的影響。結果表明,NDSAH及肝素均能提升膿毒癥小鼠的生存率(p0.05),提高幅度分別為62.5%和 50%。3.肝素衍生物NDSAH對FIP膿毒癥小鼠模型的保護作用3.1采用伊文思藍為指示劑,考察NDSAH對FIP膿毒癥小鼠腹膜滲透性的影響結果發(fā)現,NDSAH能夠顯著降低小鼠FIP膿毒癥模型腹膜滲透性(p0.01)。3.2 采用 40kDa dextran-Texas red 及 500kDa dextran-FITC 作為指示劑,檢測了 NDSAH對FIP膿毒癥小鼠血管內皮糖萼總體積的影響采用FIP膿毒癥小鼠模型,分別靜脈注射500kDa dextran-FITC、40kDa dextran-Texas red兩種熒光檢測劑,考察各組間小鼠血管內皮糖萼總體積的變化,正常組、FIP膿毒癥小鼠和NDSAH組小鼠血管內皮糖萼總體積分別為105.9μL、37μL和64μL。結果表明,NDSAH能有效抑制膿毒癥時全身血管內皮糖萼的脫落。4.肝素衍生物NDSAH對FIP膿毒癥小鼠模型腸道保護作用和對炎癥因子水平影響4.1 HE法檢測造模3h、8h后NDSAH對FIP膿毒癥小鼠小腸組織的保護作用分別在造模后3h和8h進行了觀察。結果發(fā)現,造模3h和8h后,NDSAH均顯示出顯著保護FIP膿毒癥小鼠小腸組織損傷和壞死的作用,且NDSAH保護效果略強于肝素。4.2免疫組織化學法檢測造模3h、8h后NDSAH對FIP膿毒癥小鼠小腸組織中TNF-α、IL-6、HPA、MMP-9、HS 及 Syndecan-1 表達量的影響4.2.1 TNF-α、IL-6免疫組化結果結果表明,造模3h后FIP膿毒癥組TNF-α、IL-6的表達水平較正常組顯著升高(p0.01);與模型組相比,NDSAH可以顯著降低TNF-α、IL-6的表達水平(p0.01)。與模型組相比,肝素也具有抑制TNF-α表達的作用(p0.01),而對IL-6的表達無抑制作用(p0.05)。造模8h后FIP模型組中兩種炎癥因子表達較3h時的水平均下降。與模型組相比,NDSAH仍表現出顯著抑制TNF-α表達水平的作用(p0.01),而對IL-6表達水平僅有降低的趨勢(p0.05)。與模型組相比,肝素組TNF-α水平顯著降低(p0.01),肝素對IL-6的表達無抑制作用(p0.05)。4.2.2 HPA、MMP-9 免疫組化結果結果表明,造模3h后FIP膿毒癥組HPA、MMP-9的表達水平較正常組顯著升高(p0.01)。NDSAH可以降低模型組HPA的表達(p0.05),但對MMP-9沒有顯著的降低作用(p0.05);肝素對HPA、MMP-9均沒有顯著的抑制作用(p0.05)。造模8h后FIP膿毒癥模型組中HPA、MMP-9表達較3h時的水平均下降。在該時間點,NDSAH能夠顯著抑制HPA的表達(p0.05),對MMP-9的抑制作用則不具有顯著性差異(p0.05);與模型組相比,肝素呈現抑制HPA、MMP-9表達的趨勢,但無統計學意義(p0.05)。4.2.3 HS、Syndecan-1免疫組化結果結果表明,造模3h后FIP膿毒癥組HS、Syndecan-1的表達水平較正常組顯著下降(p0.01);NDSAH可以顯著抑制FIP膿毒癥小鼠腸組織中這兩種糖萼重要組成成分HS、Syndecan-1的含量下降(p0.05)。與模型組相比,肝素能夠顯著抑制膿毒癥時Syndecan-1含量下降(p0.01),但對膿毒癥時HS含量的下降沒有顯著影響(p0.05)。造模8h后模型組中HS、Syndecan-1含量較3h時有所提高。在該時間點,NDSAH組中HS和Syndecan-1的表達水平均較FIP模型組有提高(p0.05);而肝素組中僅Syncdean-1表達水平較FIP組增加具有顯著性差異(p0.01),對HS表達水平無顯著影響(p0.05)。4.3 ELISA方法檢測NDSAH對小鼠小腸組織MPO活性、血漿中TNF-α、IL-6水平的影響4.3.1 ELISA法檢測小腸組織MPO活性結果表明,FIP模型組小鼠腸組織中MPO水平較正常組顯著升高(p0.01),NDSAH可以顯著降低FIP膿毒癥小鼠MPO水平(p0.01);肝素組MPO活性與模型組相比無顯著差異(p0.05)。4.3.2 ELISA法檢測血漿TNF-α、IL-6結果結果表明,與正常組相比,模型組小鼠血漿中TNF-α、IL-6水平均顯著升高(p0.01);與模型組相比,NDSAH可以明顯降低血漿中TNF-α、IL-6水平(p0.01);與模型組相比,肝素具有抑制TNF-α、IL-6表達上調的趨勢,但不具有顯著性差異(p0.05)。5.肝素衍生物NDSAH對LPS所致細胞糖萼損傷的影響5.1 WGA-FITC熒光法檢測采用LPS孵育法制作細胞糖萼層損傷模型,以FITC熒光強度為量化指標。結果發(fā)現,與正常組相比,LPS作用于所觀測的三種細胞HIEC、RAW264.7巨噬細胞和HUVEC,均引起熒光強度的顯著下降(p0.05),表明細胞表面糖萼發(fā)生了損傷;與模型組相比,NDSAH作用于三種細胞皆可以顯著提高熒光強度(p0.05),表明NDSAH具有抑制LPS所致三種細胞糖萼脫落的作用;而肝素僅對LPS所致HIEC細胞糖萼損傷有顯著保護作用(p0.05)。5.2原子力顯微鏡法檢測NDSAH對LPS致細胞糖萼厚度及硬度影響的影響采用LPS孵育法制作細胞糖萼層損傷模型。結果發(fā)現,LPS作用于HIEC、RAW264.7巨噬細胞,均引起這兩種細胞表面糖萼硬度和厚度的下降;NDSAH和肝素作用于這兩種細胞,均可以減弱LPS所致的上述改變。5.3激光共聚焦熒光顯微鏡法檢測NDSAH對LPS致細胞表面糖萼損傷的影響采用LPS孵育法制作細胞糖萼層損傷模型,采用FITC-WAG對細胞膜糖萼進行染色觀測。結果發(fā)現,LPS作用于HIEC、RAW264.7巨噬細胞和HUVEC三種細胞,均導致細胞表面糖萼完整程度下降,而NDSAH和肝素能夠抑制LPS所致細胞糖萼損傷。6.結論NDSAH作為非抗凝的肝素衍生物,能夠大幅提升膿毒癥小鼠生存率,與NDSAH抑制膿毒癥時炎癥因子TNF-α、IL-6以及HPA、MMP-9、MPO的上調,從而抑制血管內皮及腸道上皮糖萼脫落的作用有關,這為進一步研發(fā)NDSAH成為糖萼保護劑用于膿毒癥治療奠定了基礎。
【圖文】：

圖２－３邋ＮＤＳＡＨ邋１３Ｃ－ＮＭＲ譜圖（上圖為ＮＤＳＡＨ，下圖為肝素）逡逑（見實驗記錄本Ｉ－ｐ５８）逡逑

圖３－１小鼠急性腹膜炎生存率挑戰(zhàn)（見實驗記錄本Ｉ－ｐ８３）逡逑＊＊表示與模型組相比，／Ｋ０．０１逡逑２７小時后，ＦＩＰ模型組中的所有小鼠死亡，存活率達到零，并且造模逡逑模４８小時后，ＮＤＳＡＨ組中的小鼠存活率不再降低，并且５０小時后小逡逑率也沒有降低。當穩(wěn)定到６０％時，肝素組小鼠的存活率在造模２４小時逡逑降低，并且肝素組小鼠的存活率在５０小時后穩(wěn)定在５０％。ＮＤＳＡＨ組小逡逑率明顯高于ＦＩＰ膿毒癥組＜０．０１），肝素組小鼠的存活率呈上升趨勢逡逑５邋）0逡逑遠等［４５４人為，肝素治療膿毒癥其治療效果勝于很多新興的抗凝藥物，逡逑廉，具有很大的應用潛力。但是，，使用中有出血風險。因此合成結構優(yōu)逡逑衍生物，削弱或消除肝素過強的抗凝特性，或可以更安全地用于膿毒癥逡逑因此，本研宄首先考察了邋ＮＤＳＡＨ對ＦＩＰ誘導的膿毒癥小鼠生存率挑戰(zhàn)逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R459.7

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本文編號：2669847