【摘要】：第一部分NEDD4-1基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)及作用分析目的檢測(cè)NEDD4-1基因在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中的表達(dá)情況,構(gòu)建NEDD4-1基因靶向RNAi慢病毒載體,并包裝病毒載體。通過(guò)干擾NEDD4-1基因在細(xì)胞株U251中的表達(dá),進(jìn)一步探討NEDD4-1基因?qū)251細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖和凋亡能力的影響作用,為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。方法首先,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)驗(yàn)證在mRNA水平上NEDD4-1基因在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中的表達(dá)。用NEDD4-1RNAi慢病毒表達(dá)載體體外感染U251細(xì)胞,下調(diào)NEDD4-1基因表達(dá),驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。然后,以RT-PCR、Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后U251細(xì)胞中NEDD4-1 mRNA和蛋白的表達(dá),并進(jìn)一步用Transwell、MTT、流式細(xì)胞技術(shù)繼續(xù)探討NEDD4-1基因在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖和凋亡過(guò)程中的作用。結(jié)果1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,NEDD4-1 mRNA在腦膠質(zhì)細(xì)胞系中表達(dá)。2.成功構(gòu)建含有NEDD4-1 RNAi的慢病毒表達(dá)載體,將該載體進(jìn)行包裝,成功感染人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞株。3.MTT繪制生長(zhǎng)曲線顯示:與U251-NC組細(xì)胞相比,U251-KD組細(xì)胞的增殖減慢(P0.05)。4.細(xì)胞周期結(jié)果表明:U251-KD組細(xì)胞相對(duì)于U251-NC組細(xì)胞,G0-G1期細(xì)胞數(shù)目均明顯增加(P0.05),S期的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P0.05),處于G2/M期細(xì)的數(shù)目無(wú)顯著差異(P0.05)。這說(shuō)明發(fā)生了 G1期阻滯。與U251-NC組細(xì)胞相比,U251-KD組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P0.05)。5.NEDD4-1基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力影響顯著。U251-KD組細(xì)胞與U251-NC組相比,轉(zhuǎn)移和侵襲能力均明顯較低(P0.01)。結(jié)論NEDD4-1基因在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá),且NEDD4-1基因可調(diào)控人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)移,并對(duì)侵襲、增殖及凋亡等生物學(xué)特性中發(fā)揮重要作用。第二部分NEDD4-1基因在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性研究目的研究E3泛素連接酶NEDD4-1基因在腦膠質(zhì)瘤組織中的相應(yīng)蛋白;探討其mRNA表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤最大直徑、膠質(zhì)瘤病理級(jí)別、Ki-67、p53指標(biāo)之間的相關(guān)性;分析不同病理級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織中MRS定量參數(shù)值與NEDD4-1表達(dá)的相關(guān)性。方法對(duì)52例病理證實(shí)為腦膠質(zhì)瘤住院患者,術(shù)前在SIMENS Prisima 3.0 T磁共振掃描儀上,使用64通道頭頸聯(lián)合線圈進(jìn)行常規(guī)MRI平掃、增強(qiáng)序列及MRS相關(guān)檢查,并在術(shù)后提取腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)的組織標(biāo)本。根據(jù)E3泛素連接酶NEDD4-1的序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物,應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)腫瘤組織中NEDD4-1 mRNA表達(dá)況。應(yīng)用免疫組化法、western blot檢測(cè)NEDD4-1蛋白在52例腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)。分析NEDD4-1表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤最大直徑、膠質(zhì)瘤病理級(jí)別、增殖抗原Ki-67、p53指標(biāo)之間的相關(guān)性;檢測(cè)NEDD4-1蛋白表達(dá)與不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤MRS磁共振信號(hào)參數(shù)變化的相關(guān)性。結(jié)果1.磁共振波譜分析揭示了人腦膠質(zhì)瘤的瘤實(shí)體和瘤周組織之間的Cho/Cr,Cho/NAA差異有統(tǒng)計(jì)意義。2.人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中NEDD4-1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞染色定位于胞漿和/或胞膜。在52例人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織標(biāo)本中,有40例腫瘤組織標(biāo)本檢測(cè)到NEDD4-1表達(dá),表達(dá)陽(yáng)性率為76.9%。在人腦膠質(zhì)瘤腫瘤組織中,不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤NEDD4-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的差異有意義(P0.05)。隨著腫瘤臨床病理級(jí)別的增高,NEDD4-1蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率也升高,并且在I～I(xiàn)V級(jí)腫瘤組織間差異顯著(P0.05)。然而,研究發(fā)現(xiàn)NEDD4-1的表達(dá)與患者的年齡、性別及腫瘤大小無(wú)相關(guān)性(P均0.05)。3.人腦膠質(zhì)瘤組織中NEDD4-1與增殖抗原Ki-67和p53均呈正相關(guān)性。4.人腦膠質(zhì)瘤組織中NEDD4-1與各級(jí)別腦膠質(zhì)瘤MRS中的Cho/Cr和Cho/NAA均呈正相關(guān)性。結(jié)論1.NEDD4-1對(duì)膠質(zhì)瘤的增殖侵襲有一定作用。NEDD4-1 mRNA和蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá),隨著腦膠質(zhì)病理級(jí)別的升高而增強(qiáng)。2.NEDD4-1結(jié)合1H-MRS作為膠質(zhì)瘤增殖侵襲性評(píng)價(jià)的有效指標(biāo)。人腦膠質(zhì)瘤組織中NEDD4-1表達(dá)與增殖抗原Ki-67和p53均呈正相關(guān)性,也與各級(jí)別腦膠質(zhì)瘤MRS中的Cho/Cr和Cho/NAA呈正相關(guān)性。第三部分磁共振擴(kuò)散峰度成像與NEDD4-1表達(dá)的相關(guān)性研究目的分析在不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中,NEDD4-1表達(dá)與DKI的MK、Ka、Kr、FA、MD參數(shù)的相關(guān)性。將DKI參數(shù)作為NEDD4-1在膠質(zhì)瘤中表達(dá)的無(wú)創(chuàng)性、預(yù)測(cè)性評(píng)估手段可行性分析。通過(guò)兩著結(jié)合,研究評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲的方法。方法回顧性收集我院2015年6月至2017年12月間,經(jīng)病理證實(shí)為腦膠質(zhì)瘤的住院患者,共52例。所有納入患者均進(jìn)行常規(guī)MRI平掃及DKI檢查。磁共振常規(guī)序列和DKI序列是在具有64通道頭頸聯(lián)合線圈的SIMENS Prisima 3.0 T磁共振掃描儀下進(jìn)行,掃描時(shí)間約30分鐘。DKI參數(shù):TR/TE=3500.0 ms/78.0 ms,b=0、500、1000、1500、2000、2500,彌散方向=30,層厚 5.0mm,層數(shù) 20,FOV=220mm×220mm,掃描時(shí)間9分01秒。圖像處理:使用DKE軟件(第三方軟件)進(jìn)行DKI數(shù)據(jù)處理,參考T2WI軸面和增強(qiáng)腫瘤的實(shí)性成分,手動(dòng)畫(huà)取ROI,并使用同層面腫瘤區(qū)對(duì)應(yīng)的對(duì)側(cè)腦白質(zhì)(NAWM)。將腫瘤區(qū)的MK、Ka、Kr、FA、MD等參數(shù)值與NAWM區(qū)相應(yīng)的腦白質(zhì)值相比,得出矯正后的各級(jí)別腦膠質(zhì)瘤對(duì)應(yīng)的MK、Ka、Kr、FA和MD等參數(shù)值。結(jié)合第二部分研究結(jié)果,對(duì)52例腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中的E3泛素連接酶NEDD4-1表達(dá)水平進(jìn)行因素方差分析(One-way ANOVA)和L-S-D檢驗(yàn)。將各級(jí)別膠質(zhì)瘤的MK值、Ka值、Kr值、FA值和MD值進(jìn)行分組,并組間比較。繪制ROC曲線,計(jì)算曲線下面積,并預(yù)測(cè)有效參數(shù)的閾值。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),Pearson線性相關(guān)或Spearman等級(jí)相關(guān)分析比較組間MK值、Ka值、Kr值、FA值和MD值與性別、年齡、NEDD4-1表達(dá)量等變量間的相關(guān)性。結(jié)果1.DKI參數(shù)MK值、Ka值、Kr值在不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。然而在不同膠質(zhì)瘤級(jí)別之間,MD值和FA值均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2.年齡與MK值之間呈正相關(guān),年齡與Ka值之間呈正相關(guān),年齡與Kr值之間呈正相關(guān),年齡與FA值之間呈負(fù)相關(guān),與MD值之間無(wú)相關(guān)性。3.各級(jí)別組膠質(zhì)瘤患者中男、女性之間的MK值、Ka值、Kr值、FA值和MD值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.腦膠質(zhì)瘤組織中NEDD4-1 mRNA表達(dá)與MK呈正相關(guān)(r=0.691 P0.01),與Ka呈正相關(guān)(r=0.604P=0.000),與Kr呈正相關(guān)(r=0.630 P=0.000),與MD值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.350P=0.011),與FA值無(wú)相關(guān)性(r=-0.061P0.05)。結(jié)論DKI有助于膠質(zhì)瘤分級(jí)惡性程度的診斷,可作為NEDD4-1在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)的預(yù)測(cè)工具。DKI聯(lián)合NEDD4-1的表達(dá)可更好地評(píng)價(jià)腦膠質(zhì)瘤的增殖侵襲分級(jí)程度。
【圖文】：

ＳＹＢＲ邋ｐｒｅｍｉｘ邋ｅｘ邋ｔａｑ邐６．０｜ｉＬ逡逑（２）邋Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ通過(guò)兩步法進(jìn)行，，并繪制熔解曲線。流程圖如下圖１．１。逡逑邐邐Ｉ邐邐Ｉ邐Ｉ邐｜逡逑Ｐａｔｔｅｒｎ邐Ｈｏｌｄ邐２邋Ｓｔｅｐ邋ＰＣＲ邐Ｄｉｔｓｏａａｔｉｏｎ逡逑Ｓｅｇｍｅｎｔ邐邐１邐１２邐１２邐３逡逑１００－逡逑：／＾一ｌ廠Ｌ廠逡逑邐０－逡逑邐Ｃｙｄｅ邐邋１邐４０邐１逡逑Ｔｅｍｐｅｆａｔｕｆｅ邋（ｄｅｇ）邐９５．０邐９５．０邐６０．０邐９５．０邐６０．０邐９５．０逡逑Ｈｏｌｄ邋Ｔｉｍｅ邋（ｍｍ邋ｓｓ）邐００：３０邐００：０５邐Ｉ邋００：３０邐００：１５邐丨邐００：３０邐邋００：１５逡逑Ｄａｔａ邋Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ邋１邋￣Ｉ￣￣ｉ￣ａ￣Ｉ￣Ｉ￣￣ｉ￣Ｉ逡逑圖１．１兩步法ＲＴ－ＰＣ邋Ｒ流程圖逡逑２．４．４數(shù)據(jù)分析逡逑ＡＣｔ＝目的基因Ｃｔ值－內(nèi)參基因Ｃｔ值；逡逑－ＡＡＣｔ＝ＮＣ組ＡＣｔ平均值－各樣品ＡＣｔ值；逡逑相對(duì)定量分析Ｆ＝２－ＡＡＣｔ；逡逑相對(duì)ＮＣ組樣品，各樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)水平由Ｆ反映。逡逑３邋ＮＥＤＤ４－１特異性干擾慢病毒載體構(gòu)建逡逑３．１技術(shù)路線逡逑線性化載體由限制性酶消化得到，用ＰＣＲ擴(kuò)增制備目的基因片段。逡逑７逡逑

目的基因片段及線性化載體通過(guò)重組反應(yīng)實(shí)現(xiàn)體外環(huán)化。反應(yīng)體系逡逑由線性化載體和目的基因擴(kuò)X棽錙渲貧傘Ｍü校茫壹ㄆ槳逕系牡タ寺。義隙匝糶鑰寺〗脅廡潁苯幼刈椴錚⒔薪峁治觶跡保�。辶x希常彩笛椴牧襄義希常玻憊ぞ咴靨邋義顯靨迕疲海牽鄭保保擔(dān)誨義希稿義

本文編號(hào)：2668678