【摘要】：目的:異質(zhì)性耐藥(Heteroresistance,HR)是細(xì)菌由敏感狀態(tài)進(jìn)化至耐藥狀態(tài)的中間階段和必經(jīng)過(guò)程,但其產(chǎn)生原因尚不明確。本研究探討了碳青霉烯異質(zhì)性耐藥銅綠假單胞菌(CarbapenemheteroresistancPseudomonas aeruginosa,CHPA)的分子流行病學(xué)、耐藥機(jī)制、患者獨(dú)立危險(xiǎn)因素和臨床轉(zhuǎn)歸,以及大腸埃希菌碳青霉烯異質(zhì)性耐藥(Carbapenemheteroresistanc Escherichia coli,CHEC)的分子機(jī)制,以便更好的了解CHR在不同菌種間的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。方法:回顧性收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2011年1月到2015年12月無(wú)菌體液中分離的非重復(fù)銅綠假單胞菌451株,Vitek2 Compact系統(tǒng)完成菌株藥敏實(shí)驗(yàn),紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer disk diffusion test,K-B 法)、菌落譜型分析(Population Analysis Profile,PAP)和Time-Killing實(shí)驗(yàn)完成異質(zhì)性耐藥表型檢測(cè),脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)完成CHR菌株同源性檢測(cè)及分子流行病學(xué)特征分析;微量肉湯稀釋法檢測(cè)異質(zhì)性耐藥原始菌和PAP實(shí)驗(yàn)最高濃度下生長(zhǎng)的耐藥亞群的MIC值,RT-qPCR(Quantitative Real-time PCR)方法檢測(cè)異質(zhì)性耐藥原始菌和PAP實(shí)驗(yàn)最高濃度下生長(zhǎng)的耐藥亞群的外排泵基因、膜孔蛋白基因和產(chǎn)AmpC酶基因表達(dá)水平;統(tǒng)計(jì)臨床資料并運(yùn)用SPSS.21軟件分析CHR菌感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素及CHR發(fā)生率與碳青霉烯抗生素使用量的相關(guān)性。此外,K-B法初篩E.coli對(duì)亞胺培南(Imipenem,IPM)異質(zhì)性耐藥表型,并經(jīng)菌落譜型分析實(shí)驗(yàn)證實(shí);PCR(Polymerase chain reaction)擴(kuò)增及測(cè)序的方法檢測(cè)亞胺培南異質(zhì)性耐藥大腸埃希菌(IPM-heteroresistant,IPM-HR)中與碳青霉烯耐藥有關(guān)的基因,包括碳青霉烯酶基因、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended Spectrum Beta-Lactamases,ESBLs)基因和膜孔蛋白(Outer membrane proteins,OMPs)基因;基因替換技術(shù)進(jìn)行膜孔蛋白OmpF突變序列的替換,并進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。結(jié)果:1、銅綠假單胞菌碳青霉烯異質(zhì)性耐藥及機(jī)制研究結(jié)果如下:(1)統(tǒng)計(jì)K-B法藥敏結(jié)果發(fā)現(xiàn):P.aeruginosa對(duì)IPM的藥敏情況為:異質(zhì)性耐藥菌株245株(占54.3%),敏感菌株126株(占27.9%),耐藥菌株69株(占15.3%),中介菌株11株(占2.5%)。而對(duì)MEM的藥敏情況分別為:異質(zhì)性耐藥菌株327株(72.5%),敏感菌株76株(16.9%),耐藥菌株40株(8.7%),中介菌株8株(1.9%)。進(jìn)一步分析2011年到2015年無(wú)菌體液分離的451株銅綠假單胞菌的異質(zhì)性耐藥率,發(fā)現(xiàn)MEM的異質(zhì)性耐藥率為72.5%,明顯高于IPM的54.3%,且IPM和MEM的異質(zhì)性耐藥率逐年增加。(2)CHPA菌同源性分析結(jié)果顯示:異質(zhì)性耐藥菌原始菌和PAP實(shí)驗(yàn)最高濃度下生長(zhǎng)的耐藥亞群PFGE譜型一致;而99株臨床CHR菌株間PFGE譜型各異,并未出現(xiàn)3株及以上PFGE譜型相同的菌株。(3)CHPA耐藥機(jī)制研究:異質(zhì)性耐藥原始菌與其耐藥亞群的MIC值呈現(xiàn)8倍或16倍差異。與原始菌相比,IPM-HR和MEM-HR耐藥亞群的AmpC基因表達(dá)分別增高了 1.04-1.32倍和1.14-1.43倍,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);IPM-HR和MEM-HR耐藥亞群的外排泵基因表達(dá)均有所增高,但發(fā)現(xiàn)IPM-HR耐藥亞群的MexB和MexE基因表達(dá)分別增高了 1.58-1.78倍和1.96-2.64倍,MEM-HR耐藥亞群的MexB基因表達(dá)增高了 1.74-2.12倍,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);IPM-HR和MEM-HR耐藥亞群的膜孔蛋白OprD基因表達(dá)下調(diào)了 0.56-0.12倍(P0.05)。(4)危險(xiǎn)因素分析結(jié)果顯示:男性、引流管和先前使用碳青霉烯抗生素是IPM-HR菌感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;而轉(zhuǎn)院和先前使用碳青霉烯抗生素是MEM-HR菌感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;先前使用碳青霉烯抗生素是IPM-HR和MEM-HR菌感染的共同獨(dú)立危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步分析IPM-HR發(fā)生率與碳青霉烯類抗生素使用量呈正相關(guān),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001,r2=0.941),MEM-HR發(fā)生率與碳青霉烯類抗生素使用量也呈正相關(guān),差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001,r2=0.918)。2、E.coli碳青霉烯異質(zhì)性耐藥機(jī)制研究結(jié)果如下:(1)K-B藥敏結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌N8591為IPM-HR菌并經(jīng)PAP實(shí)驗(yàn)證實(shí);該菌株對(duì)氨曲南、環(huán)丙沙星、慶大霉素、三代頭孢和四代頭孢菌素等絕大部分抗生素耐藥,對(duì)厄他培南為低水平耐藥(MIC值為2μg/mL),而對(duì)亞胺培南為異質(zhì)性耐藥。(2)對(duì)該菌株耐藥基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其不表達(dá)blaaKPC、blaNDM-1、blaIMP和blaVIM等產(chǎn)碳青霉烯酶基因;檢出ESBLs基因blaCTX-M-3;膜孔蛋白OmpF基因在序列788位點(diǎn)共發(fā)生19個(gè)堿基缺失,打亂了其閱讀框架,導(dǎo)致膜孔蛋白OmpF缺失。(3)成功將N8591菌的OmpF突變序列替換到標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922的OmpF上,通過(guò)K-B藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)替換后的菌株ATCC25922/WompF株也出現(xiàn)IPM異質(zhì)性耐藥表型并得到PAP實(shí)驗(yàn)證實(shí)。隨機(jī)選擇4株IPM-HR菌,PCR擴(kuò)增OmpF基因并測(cè)序比對(duì),發(fā)現(xiàn)這4株菌的OmpF基因并未發(fā)生與N8591菌OmpF基因相同突變。結(jié)論:異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象普遍存在,其發(fā)生機(jī)制可能也是多樣復(fù)雜的:1、銅綠假單胞菌對(duì)IPM和MEM存在高異質(zhì)性耐藥率,這些臨床菌株間未存在暴發(fā)流行情況,膜孔蛋白OprD基因表達(dá)下調(diào)合并外排泵基因表達(dá)增強(qiáng)是其主要耐藥機(jī)制,而先前使用碳青霉烯類抗生素是CHPA菌感染的共同的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。2、膜孔蛋白OmpF缺失可能是大腸埃希菌IPM-HR現(xiàn)象產(chǎn)生的機(jī)制之一。
【圖文】：

逡逑其為非異質(zhì)性耐藥（見(jiàn)圖１．１中的Ａ和Ｃ），可分為敏感、中介和耐藥；而在抑菌逡逑圈內(nèi)存在有大小不等的細(xì)菌菌落生長(zhǎng)，則可初步判定其為異質(zhì)性耐藥（見(jiàn)圖１．１中逡逑的Ｂ和Ｄ）。逡逑ＤＯ逡逑Ａ邐Ｂ逡逑Ｃ邐Ｄ逡逑圖１．１銅綠假單胞菌ＩＰＭ和ＭＥＭ的Ｋ－Ｂ法結(jié)果逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｋ－Ｂ邋ｔｅｓｔ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＩＰＭ邋ａｎｄ邋ＭＥＭ邋ｉｎ邋Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ逡逑３．２異質(zhì)性耐藥菌株的確認(rèn)逡逑ＰＡＰ實(shí)驗(yàn)和Ｔｉｍｅ－Ｋｉｌｌｉｎｇ實(shí)驗(yàn)均是判定實(shí)驗(yàn)菌株是否存在耐藥亞群的方法，以逡逑下是其判定標(biāo)準(zhǔn)，（１）邋ＰＡＰ實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌在最高非抑菌抗生素濃度到最低完全抑菌逡逑抗生素濃度之間大于等于８倍關(guān)系，當(dāng)可證實(shí)為異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象［９］）。（２）逡逑Ｔｉｍｅ－Ｋｉｌｌｉｎｇ實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌在４倍菌株的ＭＩＣ值抗生素作用下菌落出現(xiàn)先下降后重新逡逑再生長(zhǎng)，可證實(shí)菌株中存在耐藥亞群。從圖１．２中ＰＡＰ曲線可以看出異質(zhì)性耐藥逡逑菌株在對(duì)ＩＰＭ和ＭＥＭ均出現(xiàn)了大于等于８倍的折點(diǎn)，而敏感菌株和耐藥菌株則逡逑沒(méi)有，從Ｔｉｍｅ－Ｋｉｌｌｉｎｇ曲線可看出，敏感菌株沒(méi)有出現(xiàn)再生長(zhǎng)現(xiàn)象，而異質(zhì)性耐藥逡逑菌株則出現(xiàn)了先殺死敏感亞群

逡逑其為非異質(zhì)性耐藥（見(jiàn)圖１．１中的Ａ和Ｃ），可分為敏感、中介和耐藥；而在抑菌逡逑圈內(nèi)存在有大小不等的細(xì)菌菌落生長(zhǎng)，則可初步判定其為異質(zhì)性耐藥（見(jiàn)圖１．１中逡逑的Ｂ和Ｄ）。逡逑ＤＯ逡逑Ａ邐Ｂ逡逑Ｃ邐Ｄ逡逑圖１．１銅綠假單胞菌ＩＰＭ和ＭＥＭ的Ｋ－Ｂ法結(jié)果逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｋ－Ｂ邋ｔｅｓｔ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＩＰＭ邋ａｎｄ邋ＭＥＭ邋ｉｎ邋Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ逡逑３．２異質(zhì)性耐藥菌株的確認(rèn)逡逑ＰＡＰ實(shí)驗(yàn)和Ｔｉｍｅ－Ｋｉｌｌｉｎｇ實(shí)驗(yàn)均是判定實(shí)驗(yàn)菌株是否存在耐藥亞群的方法，以逡逑下是其判定標(biāo)準(zhǔn)，（１）邋ＰＡＰ實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌在最高非抑菌抗生素濃度到最低完全抑菌逡逑抗生素濃度之間大于等于８倍關(guān)系，當(dāng)可證實(shí)為異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象［９］）。（２）逡逑Ｔｉｍｅ－Ｋｉｌｌｉｎｇ實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌在４倍菌株的ＭＩＣ值抗生素作用下菌落出現(xiàn)先下降后重新逡逑再生長(zhǎng)，，可證實(shí)菌株中存在耐藥亞群。從圖１．２中ＰＡＰ曲線可以看出異質(zhì)性耐藥逡逑菌株在對(duì)ＩＰＭ和ＭＥＭ均出現(xiàn)了大于等于８倍的折點(diǎn)，而敏感菌株和耐藥菌株則逡逑沒(méi)有，從Ｔｉｍｅ－Ｋｉｌｌｉｎｇ曲線可看出，敏感菌株沒(méi)有出現(xiàn)再生長(zhǎng)現(xiàn)象，而異質(zhì)性耐藥逡逑菌株則出現(xiàn)了先殺死敏感亞群
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R446.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 孫坤玲;大腸埃希菌碳青霉烯異質(zhì)性耐藥分子機(jī)制研究及碳青霉烯酶表型檢測(cè)方法評(píng)價(jià)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2660700