【摘要】：布魯氏菌病(brucellosis)(簡稱布病)是由布魯氏菌(Brucella)引發(fā)的目前世界上流行最廣、危害最大的人獸共患病之一,威脅著人和60余種動物的生命健康。我國布病疫情在近幾年急劇上升,布病已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題。布病的防控尤為重要,目前,布病實驗室診斷主要技術(shù)包括虎紅平板試驗(RBPT),試管凝集試驗(SAT),酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和補體結(jié)合試驗(CFT)等,RBPT和SAT方法操作簡便,結(jié)果便于觀察,存在人為判斷檢測結(jié)果的主觀性問題,且特異性不高,敏感性低;ELISA適合大批量血清學(xué)調(diào)查,但因其條件要求高,現(xiàn)場操作不便;補體結(jié)合試驗敏感性(23.0-97.1%)和特異性(30.6-100.0%)都不穩(wěn)定,且試劑昂貴,其應(yīng)用受到極大限制。因此探索一種低成本、快速、特異的檢測手段對于布魯氏菌病的防控具有十分重要的意義�，F(xiàn)有的血清學(xué)檢測方法主要基于抗原抗體的反應(yīng),而目前國內(nèi)布魯氏菌抗體產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊,國外已有比較成熟的商品化抗體,抗體試劑主要依賴于進口,但價格十分昂貴。制備高效價、特異性強、低成本的布魯氏菌單克隆抗體可為布病防控提供有效試劑�；诮涣鲃与娦�(yīng)的微粒操控電極芯片具有體積小、成本低、覆蓋面廣、靈敏度強、操作簡便等優(yōu)點,利用基于交流動電效應(yīng)的微粒操控技術(shù),可將傳統(tǒng)的ELISA的檢驗時間從數(shù)個小時縮短到1分鐘之內(nèi),同時還具有非常低的檢出限,國外研究者已將該技術(shù)用來檢測血清中的雙酚A(BPA),寨卡病毒RNA、人體D-Dimer生物標志物以及測革蘭氏陰性菌等,均取得了理想的實驗結(jié)果。該技術(shù)有望用于臨床疾病的即時檢測。前期本實驗室已經(jīng)成功將該項技術(shù)應(yīng)用于檢測禽類新城疫病毒和豬圓環(huán)病毒抗體。本研究擬采用原核表達系統(tǒng)制備布魯氏菌外膜蛋白BP26及Omp16,利用PEG1500細胞融合技術(shù)制備Omp16單克隆抗體,為布病防控提供有效試劑。此外本研究利用制備的抗原、抗體,采用11-巰基十一烷酸(MUA)在電極芯片表面自組裝形成分子膜,其末端巰基可與電極表面金屬形成金硫鍵,以1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳酰亞胺(EDC)和N-羥基玻珀酰亞胺(NHS)活化羧基,將重組蛋白BP26及Omp16共價固定于芯片電極表面,并對未結(jié)合位點進行封閉,減少非特異性吸附,初步建立基于微粒操控技術(shù)的布病抗體診斷方法,為布病的診斷提供了一種新的檢測技術(shù)。本文的研究內(nèi)容如下:(1)對布魯氏菌Omp16和bp26基因進行密碼子優(yōu)化,化學(xué)合成Omp16和bp26全基因,在bp26基因的5’段和3’段分別設(shè)計酶切位點Nde I和Xho I。將合成的bp26基因進行NdeI和XhoI雙酶切,酶切產(chǎn)物回收后,插入到同樣經(jīng)過NdeI和XhoI雙酶切回收的pET30a(+)載體中,使用DNA Ligation Kit將bp26基因克隆于pET30a(+)載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a(+)/bp26;同時構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)/Omp16。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞,構(gòu)建重組基因工程菌pET30a(+)-BP26/BL21(DE3)和pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)。通過篩選IPTG誘導(dǎo)條件(溫度、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間),得出重組基因工程菌最佳誘導(dǎo)條件,按最佳誘導(dǎo)條件進行蛋白的大量誘導(dǎo)表達,利用His-tag鎳柱純化重組蛋白,并對純化后的重組蛋白進行SDS-PAGE純度分析、二喹啉甲酸(BCA)法濃度測定及Western-blot鑒定。(2)以純化的布魯氏菌Omp16重組蛋白作為抗原,采用長程免疫法免疫BALB/c小鼠,以PEG1500作為誘導(dǎo)劑進行細胞融合,融合后10天左右,通過間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞,并采用有限稀釋法進行2-3次亞克隆以獲得能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株,接種于小鼠腹腔誘生腹水制備單抗,對純化所得抗體進行純度、效價、亞類、濃度以及特異性測定;(3)將基于交流動電效應(yīng)的微粒操控芯片用于布病抗體的檢測。首先對微電極芯片的清洗條件以及自組裝修飾條件進行優(yōu)化,然后將純化所得Omp16以及BP26抗原包被于微粒操控芯片表面,并進行封閉處理,制備微粒操控生物芯片,用于布病抗體的檢測,分別從靈敏度、特異性、重復(fù)性三方面對該檢測方法進行初步評價。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建重組基因工程菌 pET30a(+)-BP26/BL21(DE3)和 pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3),通過篩選誘導(dǎo)條件發(fā)現(xiàn),Omp16及BP26重組蛋白均為包涵體表達,pET30a(+)-BP26/BL21(DE3)最佳誘導(dǎo)條件為 37℃,0.5 mmol·L-1 IPTG 誘導(dǎo) 8h;pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)最佳誘導(dǎo)條件為 37℃,0.5 mmol·L-1 IPTG 為誘導(dǎo) 6h。通過親和層析鎳柱純化重組蛋白,并對純化后重組蛋白進行濃度、SDS-PAGE電泳鑒定以及Western-blot檢測,結(jié)果表明純化所得重組蛋白達到了電泳純,能夠被His-tag組氨酸單抗特異性識別,說明成功在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達出Omp16及BP26蛋白。(2)以純化的Omp16重組蛋白作為免疫原,其進行了兩次細胞融合,融合率分別為65.2%和89.4%,陽性率分別為38.5%和86.5%。共篩選出5株能穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細胞株,分別命名為5H1,3H1,3A3,5H11,3A11。吸取部分單抗雜交瘤細胞株細胞上清進行亞類鑒定,結(jié)果顯示:單抗細胞5H1-2H-4D/4G/5F,5H1-4C亞型為IgG2a;3H-1H-4A.3H-1H-4G亞型為IgG1。取5H1-4C細胞株接種于小鼠腹腔內(nèi),誘生腹水制備單抗,經(jīng)BCA法測定,純化所得抗體濃度可達3.725mg/mL;經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示純化后抗體純度達到了 90%以上;經(jīng)Western blot分析,在21 Ku處左右出現(xiàn)明顯條帶,與Omp16條帶相符,表明所獲得單抗是特異性針對Omp16抗原;將5H1-4C單抗作梯度倍比稀釋進行ELISA檢測,結(jié)果顯示該抗體的ELISA效價達到1:1024000。(3)確定了最優(yōu)的芯片清洗方法為異丙醇浸泡20 min,無水乙醇沖洗10 s,超純水沖洗10 s后,臭氧清洗儀處理芯片20 min;最優(yōu)芯片修飾條件為5 mM MUA室溫孵育 30 min,200 mM EDC-NHS 23℃孵育 40 min。包被 Omp16 重組蛋白檢測 0.2-500 ng/mL系列單抗稀釋液,結(jié)果表明該芯片最低可以檢測到10 ng/mL的Omp16抗體,且此時檢測結(jié)果較為穩(wěn)定。包被BP26重組蛋白檢測經(jīng)布病標準競爭ELISA試劑盒鑒定的布病陰陽性血清,共檢測10份布病陽性血清以及6份陰性血清,每份樣品檢測5片芯片,與標準檢測方法相比,其檢測靈敏度(檢出陽性率)達到96%,檢測特異性(檢出陰性率)達到95.7%,且該檢測方法與其他常見牛羊病血清無交叉反應(yīng),檢測結(jié)果表明該檢測方法具有較高的特異性,可重復(fù)性良好。結(jié)論:本研究成功實現(xiàn)了在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達布魯氏菌外膜蛋白Omp16及BP26。通過兩次細胞融合,共篩選出5株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株。利用制備的抗原、抗體,初步建立了基于微粒操控技術(shù)的布魯氏菌病快速診斷方法,該方法具有較高的靈敏度、特異性強、可重復(fù)性較好,可用于布病實時定量檢測,為布病的防控提供了新的檢測技術(shù)和手段。
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重慶理工大學(xué)碩士學(xué)位論文一對電極與其周圍溶液組成的系統(tǒng)來說，則可以用如圖１．３所示征。該等效電路中各元件含義為：電極本身的電阻Ｒｗｉｒｅ，界面電阻Ｒ0ｔ，溶液體電阻Ｒｓ和電介質(zhì)層等效電容Ｃｓ。在頻率較低的時ｔ和Ｒｓ在整個系統(tǒng)的阻抗網(wǎng)絡(luò)中將起到主要作用，此時的等效電為２個界面電容（２個電極與溶液的交界面）與１個溶液體電阻簡化后的電路，，界面電容值與溶液體電阻值就可以直接通過阻抗

交流電壓值（遠遠高于使用５邋ｍＶ的傳統(tǒng)的電阻抗傳感器）來檢測電阻抗的變化，使逡逑用較高的交流電壓值才可以產(chǎn)生交流電熱效應(yīng)（ＡＣＥＴ），進而才能夠吸引目標蛋白質(zhì)逡逑到電極表面，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)加速免疫吸附測定，可在１邋ｍｉｎ內(nèi)完成檢測，如圖１．４逡逑所示。逡逑■■■■■＂？邋：？＜邋丫丫＾人丫邋丫丫邐＊！邋■邋．邋．邐＇邋■邋－１；邋｜逡逑ｍｒｒｒｍ邋邐邐邋ＹｉＶｎｒｔｈＶ邐；邐１邋以；逡逑—0逡逑圖１．４利用交流動電效應(yīng)加速阻抗免疫反應(yīng)逡逑Ｆｉｇ．邋１．４邋Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ邋Ｉｍｐｅｄａｎｃｅ邋Ｉｍｍｕｎｅ邋Ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｗｉｔｈ邋ＡＣ邋Ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ邋Ｅｆｆｅｃｔ．逡逑１１逡逑
【學(xué)位授予單位】：重慶理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R516.7;R446.6

【參考文獻】

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本文編號：2660355