發(fā)布時(shí)間：2020-05-11 08:29

【摘要】：[研究背景和意義]革蘭氏陰性(Gram negative,G~-)細(xì)菌感染是導(dǎo)致膿毒癥的主要致病菌。G~-細(xì)菌釋放的內(nèi)毒素又稱脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是導(dǎo)致膿毒癥的重要因素。G~-細(xì)菌入侵機(jī)體后,宿主免疫系統(tǒng)在感染局部感知識(shí)別細(xì)菌并將其有效清除;但當(dāng)感染不可控時(shí),機(jī)體免疫應(yīng)答由起初的局部防御作用演變?yōu)槭Э氐南到y(tǒng)性過(guò)度應(yīng)答,不能恢復(fù)到體內(nèi)的平衡狀態(tài),最終形成以持續(xù)的過(guò)度炎癥反應(yīng)為特征的病理綜合征。目前,雖然抗感染治療和器官功能支持等療法在一定程度上改善了膿毒癥癥狀,但是膿毒癥發(fā)病率和死亡率仍居高不下。究其原因,主要是對(duì)機(jī)體在感染中反應(yīng)失調(diào)的機(jī)制,尤其是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)如何由早期對(duì)細(xì)菌感染的局部應(yīng)答和防御,演變?yōu)楹笃诘南到y(tǒng)性炎癥反應(yīng)的過(guò)程仍不清楚。因此深入認(rèn)識(shí)宿主早期對(duì)細(xì)菌感染的防御識(shí)別,及大量細(xì)菌物質(zhì)如LPS釋放引發(fā)的失控性炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制,對(duì)闡明細(xì)菌感染演變?yōu)槟摱景Y的病理過(guò)程,并尋求新的靶向干預(yù)措施具有非常重要的臨床意義。血漿高分子量激肽原HK(High molecular weight kininogen,HK)是血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Plasma kallikrein-kinin system,KKS)的主要成員。進(jìn)化分析顯示KKS系統(tǒng)與天然免疫系統(tǒng)同源進(jìn)化,尤其是HK在調(diào)控免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。且HK可與多種G~-細(xì)菌結(jié)合,與G~-細(xì)菌感染及膿毒癥發(fā)病密切相關(guān)。但是HK在宿主應(yīng)答G~-細(xì)菌感染及其所致膿毒癥中的確切作用及相應(yīng)機(jī)制目前仍不清楚。[研究目的]明確HK在感染早期宿主應(yīng)答識(shí)別G~-細(xì)菌和后期內(nèi)毒素血癥形成及其所致系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制。[研究方法]1.Kng1基因敲除小鼠的制備與鑒定懫用Cre/loxp系統(tǒng)敲除Kng1基因的2-3號(hào)外顯子,制備全身性Kng1基因敲除小鼠,并分別從基因組DNA水平,肝臟mRNA水平以及血漿蛋白水平進(jìn)行鑒定。2.在體觀察HK在細(xì)菌感染所致膿毒癥中的作用采用小鼠盲腸結(jié)扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)和E.coli腹腔感染兩種細(xì)菌感染模型,觀察Kng1~(+/+)與Kng1~(-/-)兩組小鼠生存率;E.coli細(xì)菌感染后HE染色組織病理學(xué)分析肺組織損傷情況;血平板涂板計(jì)數(shù)菌落克隆形成數(shù)(colony-forming units,CFU)分析小鼠血漿、肝臟和脾臟的載菌量,評(píng)價(jià)小鼠體內(nèi)的細(xì)菌負(fù)載情況;Luminex檢測(cè)小鼠血漿中主要促炎因子水平。3.體外檢測(cè)HK對(duì)E.coli細(xì)菌增殖的影響E.coli細(xì)菌分別與野生型大、小鼠和HK缺乏大、小鼠的血漿共培養(yǎng),運(yùn)用酶標(biāo)儀實(shí)時(shí)記錄OD值變化情況,繪制細(xì)菌增殖曲線;LB固培涂板計(jì)數(shù)細(xì)菌CFU,綜合評(píng)價(jià)HK對(duì)細(xì)菌增殖的影響。4.HK與E.coli細(xì)菌結(jié)合情況(1)體內(nèi)檢測(cè)HK與細(xì)菌的結(jié)合情況。Kng1~(-/-)小鼠耳部皮下接種E.coli后,分別給予靜脈注射碘化標(biāo)記的HK蛋白~(125)I-HK和對(duì)照蛋白~(125)I-BSA,2小時(shí)后小動(dòng)物同位素活體成像檢測(cè)HK是否與E.coli結(jié)合。(2)體外流式分析FITC標(biāo)記的HK蛋白FITC-HK與E.coli細(xì)菌的結(jié)合能力。5.HK與G~-細(xì)菌結(jié)合的機(jī)制分析(1)流式細(xì)胞術(shù)分析FITC-HK與G~-細(xì)菌結(jié)合是否依賴于標(biāo)志物分子LPS。(2)HK與LPS結(jié)合水平的概況分析。親和共沉淀檢測(cè)LPS與人、小鼠血漿中HK是否直接結(jié)合;ELISA親和實(shí)驗(yàn)分析HK純蛋白與LPS的結(jié)合情況;表面等離子體共振法定量測(cè)定HK與不同G~-細(xì)菌種屬來(lái)源的LPS結(jié)合水平,并分析HK與LPS組成部份脂質(zhì)A(Lipid A)的結(jié)合能力,以解離平衡常數(shù)KD值(KD=結(jié)合速率常數(shù)K_a/解離速率常數(shù)K_d)表示;蛋白液相色譜(Fast protein liquid chromatograpHy,FPLC)分析液相條件下LPS與HK形成復(fù)合物的特性并計(jì)算LPS與HK結(jié)合的分子摩爾比。(3)解析HK輕鏈第五結(jié)構(gòu)域中與LPS結(jié)合的功能序列合成8條30個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的重疊肽,每條多肽序列依次以15個(gè)氨基酸重復(fù)遞進(jìn),覆蓋第五結(jié)構(gòu)氨基酸序列全長(zhǎng)(402V-520G)。采用親和共沉淀法檢測(cè)各多肽序列是否競(jìng)爭(zhēng)性抑制HK與LPS的結(jié)合。(4)HK與細(xì)菌結(jié)合是否被活化裂解建立E.coli細(xì)菌腹腔感染模型,ELISA檢測(cè)血漿中BK含量;制備特異性識(shí)別HK的LPS結(jié)合位點(diǎn)(即DHGHKHKHGHGHGKH,DHG15)的單克隆抗體6C9G4,通過(guò)蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)G~-細(xì)菌感染膿毒癥患者和E.coli細(xì)菌感染小鼠血漿中是否含有DHG15序列抗原表位的HK活化裂解片段。6.HK在宿主抵抗G~-細(xì)菌感染所致膿毒癥中的作用機(jī)制(1)ExPASy網(wǎng)站軟件(Compute pI/Mw)分析DHG15序列的等電點(diǎn),電荷等理化特性。(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FITC標(biāo)記的DHG15多肽序列(FITC-DHG15)與E.coli細(xì)菌的結(jié)合情況。(3)梯度濃度的DHG15多肽與E.coli細(xì)菌共孵育后,流式細(xì)胞術(shù)分析碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)陽(yáng)性細(xì)菌百分比(PI陽(yáng)性定義為細(xì)菌胞膜發(fā)生溶解的細(xì)菌),LB固培涂板計(jì)數(shù)細(xì)菌CFU,綜合評(píng)價(jià)DHG15多肽的殺菌效應(yīng)。(4)DHG15多肽序列的毒理分析CCK-8法檢測(cè)DHG15多肽對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞毒性;紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DHG15多肽對(duì)小鼠紅細(xì)胞的溶血活性。(5)DHG15肽在體內(nèi)的抗菌效應(yīng)。建立E.coli細(xì)菌腹腔感染模型,靜脈給予DHG15多肽,16小時(shí)后取材血平板涂板計(jì)數(shù)細(xì)菌CFU(包括血液及肝臟、脾臟、腎臟組織研磨液),分析小鼠體內(nèi)載菌量情況。7.判定HK在LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥中的作用采用腹腔注射LPS建立小鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)的膿毒癥模型,觀察Kng1~(+/+)與Kng1~(-/-)兩組小鼠生存率;Luminex檢測(cè)血漿中促炎因子TNF-α,IL-1β,IL-6和HMGB-1的水平;制作肺組織病理切片,HE染色檢測(cè)肺組織病理變化。8.HK對(duì)LPS代謝清除的影響(1)應(yīng)用顯色基質(zhì)鱟試劑(Limulus Amebocyte Lysate,LAL)測(cè)定小鼠、大鼠內(nèi)毒素血癥模型中血漿循環(huán)LPS含量。進(jìn)一步運(yùn)用高效液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC/MC/MC)分析LPS萃取物3-羥基十四烷酸(3-hydroxytetradecanoic acid,3-HM)含量,測(cè)定大鼠內(nèi)毒素血癥模型中血漿LPS濃度。(2)將碘化標(biāo)記的LPS(~(125)I-LPS)靜脈注射30分鐘后收集外周血血漿和肝臟,檢測(cè)血漿和肝臟組織中的的放射性含量。(3)DHG15序列在HK維持LPS血漿濃度的作用應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系制備缺失DHG15序列的HK蛋白:HK/Δ492-506,將HK/Δ492-506蛋白靜脈注射入Kng1~(-/-)小鼠后再給小鼠腹腔注射LPS,LAL法檢測(cè)蛋白注射前后小鼠血漿中LPS含量。9.HK裂解產(chǎn)物HKa(雙鏈HK)及其功能域LC對(duì)LPS活性的影響(1)應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)BODIPY FL-LPS熒光動(dòng)態(tài)變化,分析HK及其活化產(chǎn)物HKa,HC以及LC對(duì)LPS的解聚情況。LPS解聚程度與BODIPY的熒光強(qiáng)度呈正比。(2)ELISA法檢測(cè)HKa和LC對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7單核細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的生物學(xué)活性影響。10.運(yùn)用6C9G4單克隆抗體抑制LPS與HK的結(jié)合在治療LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥中的作用觀察6C9G4抗體治療后是否緩解LPS所致小鼠死亡率,系統(tǒng)炎癥性反應(yīng)以及肺組織病理?yè)p傷程度;分析支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中總蛋白量,白細(xì)胞總數(shù)和髓過(guò)氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)含量評(píng)價(jià)肺組織炎癥程度。11.人與小鼠HKa調(diào)節(jié)LPS生物學(xué)活性的差異(1)應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)人源HKa(hHKa)和鼠源HKa(mHKa)對(duì)LPS的解聚效率和解聚程度。(2)ELISA法分析hHKa和mHKa對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7單核細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的活性影響。(3)Western blotting法檢測(cè)人與小鼠血漿中單鏈HK的含量。[研究結(jié)果]1.Kng1基因敲除小鼠制備成功鼠尾基因組PCR鑒定可見(jiàn)Kng1基因2號(hào)和3號(hào)外顯子被成功敲除;RT-PCR結(jié)果顯示Kng1基因敲除小鼠(Kng1~(-/-))肝臟組織中Kng1 mRNA無(wú)表達(dá),但不影響Kng2 mRNA的正常表達(dá);免疫印跡結(jié)果進(jìn)一步顯示Kng1~(-/-)小鼠血漿中無(wú)HK蛋白表達(dá),表明Kng1基因敲除小鼠構(gòu)建成功。2.HK在細(xì)菌感染所致膿毒癥中發(fā)揮宿主抵抗的保護(hù)作用。在CLP和大腸桿菌E.coli細(xì)菌腹腔感染兩個(gè)膿毒癥模型中,HK缺乏的Kng1~(-/-)小鼠生存率較野生型Kng1~(+/+)小鼠顯著降低,與此相應(yīng)地可見(jiàn)HK缺乏顯著加重E.coli細(xì)菌感染小鼠肺組織損傷,增強(qiáng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)并增加臟器和血液的載菌量。3.體外細(xì)菌增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血漿HK的缺乏促進(jìn)E.coli細(xì)菌增殖,表明HK具有殺菌或抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。4.HK與E.coli細(xì)菌直接結(jié)合(1)小動(dòng)物同位素活體成像顯示HK在體內(nèi)可快速募集至E.coli細(xì)菌感染灶處。(2)體外流式結(jié)果可見(jiàn)HK與E.coli細(xì)菌呈濃度依賴性結(jié)合,在約100nM HK時(shí)到達(dá)飽和。5.HK通過(guò)位于輕鏈第五結(jié)構(gòu)域的DHG15序列與LPS結(jié)合識(shí)別G~-細(xì)菌并被活化(1)當(dāng)EDTA提前處理E.coli使LPS解體后,HK與E.coli細(xì)菌的結(jié)合幾乎完全消失,表明HK通過(guò)LPS與E.coli細(xì)菌結(jié)合。(2)LPS微球特異性與血漿中HK蛋白結(jié)合而將其親和沉降出來(lái),而對(duì)照微球未見(jiàn)相應(yīng)HK條帶;親和ELISA檢測(cè)可見(jiàn)HK與LPS呈濃度依賴性結(jié)合;HK通過(guò)LPS糖鏈結(jié)構(gòu)與G~-細(xì)菌不同種屬來(lái)源的LPS(K.pneumoniae,P.aeruginosa,S.minnesota)呈高親和性結(jié)合,解離平衡常數(shù)為皮摩爾水平。FPLC結(jié)果顯示HK與LPS結(jié)合后形成HK/LPS復(fù)合物,平均每個(gè)LPS分子結(jié)合1-2個(gè)HK分子。(3)免疫印跡結(jié)果顯示只有第6條和第7條多肽可競(jìng)爭(zhēng)性抑制HK與LPS的結(jié)合。分析多肽6和多肽7的序列可得兩者的共有序列是DHGHKHKHGHGHGKH,將其命名為DHG15。提示位于HK第五結(jié)構(gòu)域中的DHG15序列是HK與LPS結(jié)合的功能性位點(diǎn)。(4)G~-細(xì)菌膿毒癥患者和E.coli細(xì)菌感染小鼠的血漿中可見(jiàn)HK活化裂解暴露出DHG15序列表位的降解片段。6.DHG15多肽是宿主防御性多肽DHG15序列表現(xiàn)出和天然抗菌肽類(lèi)似的特性,如表面帶正電荷。DHG15多肽呈濃度依賴性與E.coli細(xì)菌直接結(jié)合,對(duì)E.coli細(xì)菌具有與LL-37相當(dāng)?shù)臍⒕?yīng),但對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)溶血活性并表現(xiàn)出低毒性,是一種安全的抗菌肽。DHG15多肽顯著降低小鼠感染E.coli細(xì)菌后血液和臟器中的載菌量。7.HK的缺乏對(duì)LPS所致死亡具有保護(hù)作用Kng1~(+/+)小鼠和Kng1~(-/-)小鼠腹腔注射致死劑量的LPS后,約90%的Kng1~(+/+)小鼠在50小時(shí)內(nèi)死亡,而Kng1~(-/-)小鼠全存活,相應(yīng)地可見(jiàn)HK缺乏顯著緩解了LPS導(dǎo)致的急性肺損傷,抑制了系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。8.(1)HK缺乏降低內(nèi)毒素血癥血液循環(huán)中LPS水平HK缺乏的小鼠和大鼠血液循環(huán)中LPS水平顯著降低,促進(jìn)LPS向肝臟代謝清除。(2)DHG15序列是HK維持LPS血漿濃度的關(guān)鍵位點(diǎn)Kng1~(-/-)小鼠在補(bǔ)償HK/Δ492-506重組蛋白后未見(jiàn)血漿LPS水平升高至與野生型小鼠相當(dāng)?shù)乃?證實(shí)HK中與LPS結(jié)合的DHG15氨基酸序列是HK維持LPS血漿濃度的關(guān)鍵序列。9.HK通過(guò)輕鏈LC促進(jìn)LPS生物學(xué)活性HKa及其功能域輕鏈LC,直接解聚LPS形成單體,且具有促進(jìn)LPS促炎效應(yīng)的生物學(xué)活性。10.特異性識(shí)別DHG15序列的單克隆抗體6C9G4緩解LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥通過(guò)抑制LPS與HK的結(jié)合,6C9G4抗體有效緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠死亡及急性肺損傷,顯著降低循環(huán)LPS濃度和系統(tǒng)性炎癥因子水平,同時(shí)可見(jiàn)顯著降低了BALF中的白細(xì)胞總數(shù),總蛋白量以及肺組織裂解液中MPO水平。11.人與小鼠HKa對(duì)LPS具有同等的生物學(xué)活性人源HKa(hHKa)和鼠源HKa(mHKa)與LPS的結(jié)合力相當(dāng),表現(xiàn)為等同的LPS解聚能力及對(duì)LPS促炎效應(yīng)的促進(jìn)作用,即hHKa與mHKa兩者本身具有相等的LPS生物學(xué)活性調(diào)控作用。但人血漿中與LPS結(jié)合的含DHG15序列的全長(zhǎng)單鏈HK的濃度是小鼠血漿中的2倍。[結(jié)論]1.HK是新的針對(duì)LPS的模式識(shí)別分子(Pattern recognition molecules,PRMs)。HK通過(guò)識(shí)別LPS與G~-細(xì)菌結(jié)合,感知入侵細(xì)菌的存在,并被裂解暴露出DHG15序列發(fā)揮殺菌效應(yīng),從而作為“監(jiān)視預(yù)警”分子,在宿主早期抵抗G~-細(xì)菌感染中起重要的防御保護(hù)作用。2.HK是新的關(guān)鍵LPS載體,具有持續(xù)性維持血液循環(huán)LPS水平的特異性作用,從而加強(qiáng)宿主對(duì)LPS的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng),可能是G~-細(xì)菌感染后期形成內(nèi)毒素血癥的重要機(jī)制。3.HK在宿主應(yīng)答G~-細(xì)菌感染的過(guò)程中具有“雙刃劍”效應(yīng)。G~-細(xì)菌感染早期,HK識(shí)別G~-細(xì)菌LPS而感知入侵細(xì)菌,并發(fā)揮殺菌效應(yīng);當(dāng)G~-細(xì)菌破壞釋放大量LPS時(shí),HK作為L(zhǎng)PS載體維持LPS血漿濃度,促進(jìn)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng),從有利的宿主防御轉(zhuǎn)向有害的促炎效應(yīng)。4.HK是治療內(nèi)毒素血癥的新的有效靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖1. Kng1基因敲除小鼠的構(gòu)建策略和鑒定lox小鼠的構(gòu)建策略及打靶載體示意圖。Loxp位點(diǎn)分別位于Kng1基因外顯子2和）Kng1基因敲除小鼠鑒定。B：提取小鼠鼠尾基因組，使用相應(yīng)引物對(duì)小鼠；C：提取Kng1+/+和Kng1-/-小鼠的肝臟RNA，RT-PCR檢測(cè)肝臟組織中Kng1水平，，action用作內(nèi)參；D：收集Kng1+/+和Kng1-/-小鼠血漿，Western blottin

圖 2. HK 缺乏小鼠在多菌性混合感染和 E.coli 細(xì)菌感染所致膿毒癥中更易死亡建立輕度 CLP 模型（左側(cè)圖）和 E.coli 細(xì)菌腹腔感染模型，觀察小鼠生存情況，繪制生存曲線。結(jié)果使用 log-rank test 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析. *, P < 0.05；**, P < 0.01。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R459.7

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本文編號(hào)：2658179