【摘要】：近年來,受生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)以及環(huán)境等因素影響,癌癥、慢性病等已成為困擾人類健康的主要?dú)⑹?因此,開展生物體內(nèi)疾病相關(guān)標(biāo)志性生物分子分析檢測可以為疾病診斷以及預(yù)后判斷提供可靠、強(qiáng)大的檢測和監(jiān)控策略,具有十分重要的生物醫(yī)學(xué)意義。然而,實(shí)際生物樣品中生物分子濃度動態(tài)分布范圍寬,而與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物卻往往表現(xiàn)為低豐度,因此,發(fā)展更多低豐度功能生物分子研究新策略與新方法,對于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物的快速、靈敏、準(zhǔn)確分析檢測,揭示生命活動發(fā)生與發(fā)展規(guī)律,進(jìn)而指導(dǎo)疾病的診斷與治療具有十分重要的科學(xué)意義。而電化學(xué)生物傳感器因其儀器設(shè)備簡單、操作簡便、分析速度快、檢測通量高等優(yōu)點(diǎn),成為生命分析領(lǐng)域最有發(fā)展前途的分析技術(shù)之一,在生物標(biāo)志物分析檢測方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本論文綜合運(yùn)用生物納米探針本身的結(jié)構(gòu)特征、識別特性、生物酶放大、以及核酸識別與組裝原理,合理設(shè)計(jì)識別探針,開發(fā)信號擴(kuò)增新模式,探索構(gòu)建特異性識別及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)新平臺,發(fā)展了一系列蛋白質(zhì)、核酸等疾病相關(guān)生物標(biāo)志物生物傳感新策略。主要包括以下三個(gè)部分:1、基于雙酶輔助多重放大策略的多功能免標(biāo)ctDNA電化學(xué)生物傳感器研究基于核糖核酸酶HII(RNase HII)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)雙酶輔助多重放大策略,設(shè)計(jì)構(gòu)建了多功能免標(biāo)循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)超靈敏電化學(xué)傳感平臺。獨(dú)特設(shè)計(jì)的三鏈核酸探針作為識別捕獲單元,在RNase HII輔助下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)均相循環(huán)擴(kuò)增和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)探針(STP)釋放。通過電極界面捕獲STP,并引發(fā)TdT介導(dǎo)一級延伸,形成DNA“樹干”。輔助探針(AP)與“樹干”結(jié)構(gòu)部分雜交引發(fā)TdT介導(dǎo)二級延伸,由此產(chǎn)生穩(wěn)定的DNA樹枝狀結(jié)構(gòu),最終得到電活性分子亞甲基藍(lán)(MB)標(biāo)記的電活性樹,達(dá)到對ctDNA的靈敏和精準(zhǔn)檢測。該方法將三鏈分子開關(guān)(THMS)高效識別、RNase HII輔助循環(huán)放大和TdT介導(dǎo)級聯(lián)擴(kuò)增相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物多重?cái)U(kuò)增和高靈敏檢測,其檢測范圍為0.01 fM-1 pM,檢出限低至2.4 aM。更重要的是,該傳感平臺只需通過改變RP環(huán)部序列就可以很容易實(shí)現(xiàn)對其它c(diǎn)tDNA的通用性檢測。因此,該策略為ctDNA的檢測提供了多功能通用化工具,具有通用型基因相關(guān)分子診斷的潛力。2、基于Pt/UiO-66的磷酸化蛋白電化學(xué)檢測平臺研究基于Pt/UiO-66功能復(fù)合材料,構(gòu)建了磷酸化蛋白電化學(xué)檢測平臺。首先合成了結(jié)合Pt納米粒子優(yōu)異電催化活性與UiO-66良好的磷酸化蛋白分離富集能力的Pt/UiO-66復(fù)合材料,通過TEM、SEM、XRD、TGA、N_2吸附-脫附等實(shí)驗(yàn)手段對制得材料的形貌、微觀結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性等性能進(jìn)行了表征,證實(shí)制備的Pt/UiO-66表面分布均勻,熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性良好。通過復(fù)合材料中UiO-66發(fā)揮磷酸化蛋白識別富集功能,富集的磷酸蛋白會覆蓋材料表面Pt納米粒子進(jìn)而影響復(fù)合材料催化H_2O_2還原的電催化活性,實(shí)現(xiàn)電化學(xué)磷酸蛋白定量分析策略。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,該傳感平臺對磷酸化蛋白?-Casein和?-Casein表現(xiàn)出較好的選擇特異性,檢測范圍分別為0.1 ng ml~(-1)-1 mg ml~(-1)、0.01 ng ml~(-1)-0.1 mg ml~(-1)。該策略為磷酸化蛋白定量分析提供了較好的方法,有望在磷酸化蛋白組學(xué)和臨床標(biāo)志物分析中發(fā)揮潛力。3、基于浮選分離協(xié)同T7輔助放大策略的均相ctDNA比例電化學(xué)生物傳感器研究基于功能化浮力微球探針和T7核酸外切酶(T7 Exo)輔助放大策略,設(shè)計(jì)構(gòu)建了高靈敏均相ctDNA比例型電化學(xué)傳感平臺。該體系首先構(gòu)建基于識別探針條形碼的浮力微球,目標(biāo)分子的存在引發(fā)微球負(fù)載捕獲探針(CP-Fc)釋放,并在T7 Exo輔助下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)循環(huán)放大。隨后加入的發(fā)夾探針(HP-MB)會與微球中裸露輔助探針(AP)雜交,最終在T7 Exo再次作用下引發(fā)均相比例信號放大體系,最終使得I_(Fc)/I_(MB)與目標(biāo)分子濃度呈現(xiàn)一定的相關(guān)性,實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)ctDNA的超靈敏檢測。該傳感平臺可對ctDNA PIK3CA E542 KM實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測,其檢測范圍為0.01 fM-1 pM,檢出限低至9.23 aM。該策略中的優(yōu)越性概括如下:(I)浮選分離及均相非界面的識別體系避免了電極界面修飾的繁瑣步驟,并且可以最大限度保持生物分子的空間自由度,有利于實(shí)現(xiàn)高效分子識別事件;(II)雙信號報(bào)告結(jié)果模式可以有效避免非特異性引發(fā)的假陽性與假陰性信號;(III)浮選分離概念的引入有望實(shí)現(xiàn)無需借助外力的極簡檢測理念,有望快速推廣于Point-of-Care檢測領(lǐng)域,為電化學(xué)傳感檢測提供新方法。
【圖文】：

聊城大學(xué)碩士學(xué)位論文 1.1 所示。該生物傳感器構(gòu)建的 poly A 捕獲探針 polyA-P 由識別區(qū)和別區(qū)可以特異性捕獲靶標(biāo) DNA 并與之雜交，錨定區(qū) polyA 可以與金兩者間親和力與金硫鍵相當(dāng)。通過改變 polyA 段長度輕松控制探針表得高信噪比。該傳感器檢出限可低至 5 fM，表現(xiàn)出優(yōu)異的重現(xiàn)性和穩(wěn)“夾心型”電化學(xué) DNA 生物傳感器相當(dāng)。

親和力與金硫鍵相當(dāng)。通過改變 polyA 段長度輕松控制噪比。該傳感器檢出限可低至 5 fM，表現(xiàn)出優(yōu)異的重現(xiàn)”電化學(xué) DNA 生物傳感器相當(dāng)。圖 1.1 基于聚腺嘌呤 DNA 自組裝的電化學(xué) DNA 傳感器[37]
【學(xué)位授予單位】：聊城大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R446;TP212.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉潔瓊;賀智敏;;磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年07期

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本文編號：2657458