【摘要】：近年來,受生活習慣、飲食結(jié)構(gòu)以及環(huán)境等因素影響,癌癥、慢性病等已成為困擾人類健康的主要殺手,因此,開展生物體內(nèi)疾病相關標志性生物分子分析檢測可以為疾病診斷以及預后判斷提供可靠、強大的檢測和監(jiān)控策略,具有十分重要的生物醫(yī)學意義。然而,實際生物樣品中生物分子濃度動態(tài)分布范圍寬,而與疾病相關的生物標志物卻往往表現(xiàn)為低豐度,因此,發(fā)展更多低豐度功能生物分子研究新策略與新方法,對于實現(xiàn)目標分析物的快速、靈敏、準確分析檢測,揭示生命活動發(fā)生與發(fā)展規(guī)律,進而指導疾病的診斷與治療具有十分重要的科學意義。而電化學生物傳感器因其儀器設備簡單、操作簡便、分析速度快、檢測通量高等優(yōu)點,成為生命分析領域最有發(fā)展前途的分析技術(shù)之一,在生物標志物分析檢測方面具有廣闊的應用前景。本論文綜合運用生物納米探針本身的結(jié)構(gòu)特征、識別特性、生物酶放大、以及核酸識別與組裝原理,合理設計識別探針,開發(fā)信號擴增新模式,探索構(gòu)建特異性識別及信號轉(zhuǎn)導新平臺,發(fā)展了一系列蛋白質(zhì)、核酸等疾病相關生物標志物生物傳感新策略。主要包括以下三個部分:1、基于雙酶輔助多重放大策略的多功能免標ctDNA電化學生物傳感器研究基于核糖核酸酶HII(RNase HII)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)雙酶輔助多重放大策略,設計構(gòu)建了多功能免標循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)超靈敏電化學傳感平臺。獨特設計的三鏈核酸探針作為識別捕獲單元,在RNase HII輔助下實現(xiàn)目標均相循環(huán)擴增和信號轉(zhuǎn)導探針(STP)釋放。通過電極界面捕獲STP,并引發(fā)TdT介導一級延伸,形成DNA“樹干”。輔助探針(AP)與“樹干”結(jié)構(gòu)部分雜交引發(fā)TdT介導二級延伸,由此產(chǎn)生穩(wěn)定的DNA樹枝狀結(jié)構(gòu),最終得到電活性分子亞甲基藍(MB)標記的電活性樹,達到對ctDNA的靈敏和精準檢測。該方法將三鏈分子開關(THMS)高效識別、RNase HII輔助循環(huán)放大和TdT介導級聯(lián)擴增相結(jié)合,實現(xiàn)目標物多重擴增和高靈敏檢測,其檢測范圍為0.01 fM-1 pM,檢出限低至2.4 aM。更重要的是,該傳感平臺只需通過改變RP環(huán)部序列就可以很容易實現(xiàn)對其它ctDNA的通用性檢測。因此,該策略為ctDNA的檢測提供了多功能通用化工具,具有通用型基因相關分子診斷的潛力。2、基于Pt/UiO-66的磷酸化蛋白電化學檢測平臺研究基于Pt/UiO-66功能復合材料,構(gòu)建了磷酸化蛋白電化學檢測平臺。首先合成了結(jié)合Pt納米粒子優(yōu)異電催化活性與UiO-66良好的磷酸化蛋白分離富集能力的Pt/UiO-66復合材料,通過TEM、SEM、XRD、TGA、N_2吸附-脫附等實驗手段對制得材料的形貌、微觀結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性等性能進行了表征,證實制備的Pt/UiO-66表面分布均勻,熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性良好。通過復合材料中UiO-66發(fā)揮磷酸化蛋白識別富集功能,富集的磷酸蛋白會覆蓋材料表面Pt納米粒子進而影響復合材料催化H_2O_2還原的電催化活性,實現(xiàn)電化學磷酸蛋白定量分析策略。實驗結(jié)果證明,該傳感平臺對磷酸化蛋白?-Casein和?-Casein表現(xiàn)出較好的選擇特異性,檢測范圍分別為0.1 ng ml~(-1)-1 mg ml~(-1)、0.01 ng ml~(-1)-0.1 mg ml~(-1)。該策略為磷酸化蛋白定量分析提供了較好的方法,有望在磷酸化蛋白組學和臨床標志物分析中發(fā)揮潛力。3、基于浮選分離協(xié)同T7輔助放大策略的均相ctDNA比例電化學生物傳感器研究基于功能化浮力微球探針和T7核酸外切酶(T7 Exo)輔助放大策略,設計構(gòu)建了高靈敏均相ctDNA比例型電化學傳感平臺。該體系首先構(gòu)建基于識別探針條形碼的浮力微球,目標分子的存在引發(fā)微球負載捕獲探針(CP-Fc)釋放,并在T7 Exo輔助下實現(xiàn)目標循環(huán)放大。隨后加入的發(fā)夾探針(HP-MB)會與微球中裸露輔助探針(AP)雜交,最終在T7 Exo再次作用下引發(fā)均相比例信號放大體系,最終使得I_(Fc)/I_(MB)與目標分子濃度呈現(xiàn)一定的相關性,實現(xiàn)對目標ctDNA的超靈敏檢測。該傳感平臺可對ctDNA PIK3CA E542 KM實現(xiàn)高靈敏檢測,其檢測范圍為0.01 fM-1 pM,檢出限低至9.23 aM。該策略中的優(yōu)越性概括如下:(I)浮選分離及均相非界面的識別體系避免了電極界面修飾的繁瑣步驟,并且可以最大限度保持生物分子的空間自由度,有利于實現(xiàn)高效分子識別事件;(II)雙信號報告結(jié)果模式可以有效避免非特異性引發(fā)的假陽性與假陰性信號;(III)浮選分離概念的引入有望實現(xiàn)無需借助外力的極簡檢測理念,有望快速推廣于Point-of-Care檢測領域,為電化學傳感檢測提供新方法。
【圖文】：

聊城大學碩士學位論文 1.1 所示。該生物傳感器構(gòu)建的 poly A 捕獲探針 polyA-P 由識別區(qū)和別區(qū)可以特異性捕獲靶標 DNA 并與之雜交，錨定區(qū) polyA 可以與金兩者間親和力與金硫鍵相當。通過改變 polyA 段長度輕松控制探針表得高信噪比。該傳感器檢出限可低至 5 fM，表現(xiàn)出優(yōu)異的重現(xiàn)性和穩(wěn)“夾心型”電化學 DNA 生物傳感器相當。

親和力與金硫鍵相當。通過改變 polyA 段長度輕松控制噪比。該傳感器檢出限可低至 5 fM，表現(xiàn)出優(yōu)異的重現(xiàn)”電化學 DNA 生物傳感器相當。圖 1.1 基于聚腺嘌呤 DNA 自組裝的電化學 DNA 傳感器[37]
【學位授予單位】：聊城大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R446;TP212.2

【參考文獻】

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1 劉潔瓊;賀智敏;;磷酸化蛋白質(zhì)組學技術(shù)及其在腫瘤研究中的應用[J];中南大學學報(醫(yī)學版);2008年07期

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本文編號：2657458