【摘要】：1實驗?zāi)康睦靡环N新的實驗方法——固體培養(yǎng)法,建立秀麗隱桿線蟲-肺炎克雷伯菌感染模型;利用該模型比較不同耐藥表型的肺炎克雷伯菌致病能力的差異;分析其毒力機制并進一步探討耐藥性與毒力間的聯(lián)系。2實驗方法2.1線蟲同期化處理將孕蟲收集至離心管內(nèi),洗滌、離心,棄上清液,保留3.5mL液體;加入1.5mL線蟲裂解液,劇烈震蕩至蟲體全部裂解;將收集的蟲卵用M9緩沖液洗滌3次;20℃過夜培養(yǎng),獲得L1期線蟲;將L1期線蟲轉(zhuǎn)移至NGM-OP50培養(yǎng)板,20℃培養(yǎng)48h至L4期。2.2感染平板的制備將復(fù)蘇、培養(yǎng)后的待測菌液稀釋至105cfu/mL,取10uL菌懸液滴加于SK瓊脂平板上,涂布均勻;室溫干燥后,37℃靜置培養(yǎng)8h,冷卻至室溫備用。2.3線蟲致死實驗轉(zhuǎn)接線蟲前,在每塊感染平板上滴加一定濃度的FUDR,抑制野生型線蟲生長繁殖;每塊感染平板上轉(zhuǎn)接10條L4期線蟲。以大腸埃希菌OP50喂養(yǎng)的線蟲作為實驗對照組。25 ℃培養(yǎng),每24h觀察一次線蟲的活動狀態(tài),并記錄線蟲生存狀態(tài),當線蟲無搖頭、咀嚼等動作,并呈剛性直線時,判定為死亡。2.4不同耐藥表型的肺炎克雷伯菌致病能力比較根據(jù)體外藥敏結(jié)果,將實驗組分為:敏感組、多重耐藥組、碳青酶烯類耐藥組。取不同耐藥表型的肺炎克雷伯菌分別感染線蟲(10條/皿),每株細菌至少準備3個樣本。以大腸埃希菌OP50喂養(yǎng)的線蟲作為對照組。25℃培養(yǎng),每天記錄線蟲存活狀態(tài)。2.5線蟲體內(nèi)細菌計數(shù)及鑒定在固定時間點,取肺炎克雷伯菌感染后的線蟲;疊氮化鈉清洗3次后,挑取5條線蟲加入含有無菌的PBS溶液及石英砂的EP管內(nèi),震蕩離心,使蟲體裂解,釋放細菌;取上清液進行細菌純培養(yǎng),并進行細菌菌種鑒定及藥敏測試。2.6肺炎克雷伯菌毒力因子檢測所有細菌進行拉絲實驗,并采用PCR技術(shù)進行目標基因(包括莢膜血清型及毒力基因)檢測。2.7統(tǒng)計分析以上實驗均重復(fù)3次,采用IBM SPSS Statitics 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。Kaplan-Meier方法進行生存分析,Log-rank檢驗法對組間數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。完全隨機設(shè)計資料采用單因素方差分析進行均數(shù)比較。P0.05為差異明顯。3結(jié)果3.1秀麗隱桿線蟲-肺炎克雷伯菌感染模型建立結(jié)果顯示,實驗組較對照組,線蟲致死現(xiàn)象明顯。實驗組與對照組線蟲LT50(d)分別為 8.000±0.769,11.000±0.458,二者生存曲線存在差異(χ2=27.519,P0.05)。肺炎克雷伯菌感染24h、48h、72h后,線蟲體內(nèi)細菌數(shù)量分別為1.949×104cfu/mL、0.911×105cfu/mL、1.523×106cfu/mL,不同時間點感染線蟲體內(nèi)細菌數(shù)量有統(tǒng)計學(xué)差異(F=37.192,P0.001)。經(jīng)LSD檢驗顯示,各時間點間線蟲體內(nèi)細菌數(shù)量均有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。線蟲體內(nèi)細菌菌種鑒定及藥敏結(jié)果與初始感染細菌一致。說明在實驗時間范圍內(nèi),肺炎克雷伯菌能在線蟲體內(nèi)定植、繁殖,并最終導(dǎo)致線蟲死亡。3.2不同耐藥表型肺炎克雷伯菌致病能力比較結(jié)果顯示,對照組(大腸埃希菌OP50組)線蟲LT50(d)為11.000±0.458,而敏感組、多重耐藥組(MDRKP)、碳青霉烯類耐藥組(CRKP)的LT50(d)分別為 10.000±0.231、9.000±0.080、9.000±0.130。三組致死時間(d)分別為 5.500、3.860、3.560,三組間致死時間具有統(tǒng)計學(xué)差異(F=5.610,P0.05),其中,敏感菌組與多重耐藥組(MDRKP)、敏感組與碳青霉烯類耐藥組(CRKP),致死時間均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),多重耐藥組與碳青霉烯類耐藥組致死時間無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.498)。72h后,三組線蟲體內(nèi)細菌計數(shù)(106cfu/mL)分別為1.478±0.861、1.622±0.524、1.467±0.739,各組間無統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.137,P=0.872)。3.3肺炎克雷伯菌毒力因子檢測10株臨床分離的肺炎克雷伯菌中,除敏感菌株KP3拉絲實驗及rmpA基因檢測陽性外,其余菌株拉絲試驗及毒力基因檢測均陰性。4結(jié)論4.1在國內(nèi)首次采用利用一種新的實驗方法——固體培養(yǎng)法,建立秀麗隱桿線蟲-肺炎克雷伯菌感染模型。4.2耐藥型菌株較敏感型菌株致病能力稍強,可在線蟲體內(nèi)長期定植、繁殖,導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲在更短的時間內(nèi)死亡。4.3本實驗檢測范圍內(nèi),耐藥型菌株內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致毒力增強的相關(guān)毒力因子,提示可能存在其他機制導(dǎo)致毒力增強。
【圖文】：

組）的線蟲ＬＴ５０邋（ｄ）為１１．０００±０．４５８，而敏感組、多重耐藥組（ＭＲＤＫＰ）、碳逡逑青霉烯類耐藥組（ＣＲＫＰ）的邋ＬＴ５０邋（ｄ）分別為邋１０．０００±０．２３１、９．０００±０．０８０、逡逑９．０００±０．１３０，如表２－１。各組線蟲生存曲線如圖２－１。逡逑Ｌｏｇ邋Ｒａｎｋ檢驗顯示，對照組（大腸埃希菌ＯＰ５０組）與敏感組、多重耐藥逡逑組（ＭＤＲＫＰ）、碳青霉烯類耐藥組（ＣＲＫＰ）生存曲線比較，，均有統(tǒng)計學(xué)意義（／逡逑值分別為１０．９６１、４０．２６４、４０．２８７，邋Ｐ＜０．０５）。說明不同耐藥表型的肺炎克雷伯逡逑菌均可導(dǎo)致死亡。敏感組與多重耐藥組、碳青霉烯類耐藥組生存曲線比較，均逡逑有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｘ２值分別為２３．４９７、２２．５３９，邋Ｐ＜０．０５）；多重耐藥組（ＭＤＲＫＰ）逡逑與碳青霉烯類耐藥組（ＣＲＫＰ）間生存曲線比較，無統(tǒng)計學(xué)意義（／＝０．１４８，逡逑Ｐ＝０＿７０１）。逡逑表２－１秀麗隱桿線蟲感染不同耐藥表型的肺炎克雷伯菌后的生存時間逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－ｌＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ邋ｅｌｅｇａｎｓ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R446.5

【參考文獻】

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1 王麗鳳;沈定霞;;高毒力肺炎克雷伯菌的致病機制研究進展[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2016年06期

2 康燕菲;田平芳;譚天偉;;肺炎克雷伯氏菌毒力因子的研究進展[J];微生物學(xué)報;2015年10期

3 姜如金;朱健銘;翁幸鐾;吳康樂;孔海深;;多藥耐藥肺炎克雷伯菌毒力基因研究[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2015年07期

本文編號：2656513