【摘要】：背景和目的手足口病是亞太地區(qū)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一,主要發(fā)生在年齡≤5歲的兒童,主要的病原體是柯薩奇病毒A組16型和腸道病毒71型(enterovirus 71,EV71)。EV71是一種高傳染性病毒和嗜神經(jīng)腸道病毒,已多次在亞太地區(qū)引發(fā)了手足口病的暴發(fā)和流行,是重癥手足口病和死亡病例的主要病原體。自從EV71在中國(guó)首次報(bào)道后,EV71引起的手足口病疫情在中國(guó)呈不斷上升趨勢(shì),給中國(guó)帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)和疾病負(fù)擔(dān),是中國(guó)面臨的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。1998年之后,EV71 C4基因亞型(EV71 subgenotype C4,EV71-C4)幾乎成為唯一一種在中國(guó)大陸流行的EV71基因亞型。目前仍無(wú)有效針對(duì)EV71的抗病毒藥物,早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療有助于及時(shí)防止EV71疫情擴(kuò)散,延緩病情的進(jìn)展。因此,建立一種早期、快速、準(zhǔn)確的EV71-C4檢測(cè)方法對(duì)于中國(guó)大陸預(yù)防重癥手足口病、減少死亡率和控制疾病的傳播具有重要的意義。重組聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification,RPA)是一種新型的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度和特異度高的特點(diǎn),不需要復(fù)雜的設(shè)備和專(zhuān)業(yè)的操作人員。自從RPA技術(shù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)以后,該檢測(cè)技術(shù)已應(yīng)用于艾滋病、登革熱、諾如病毒等多種病原體的檢測(cè),但目前還未將RPA技術(shù)應(yīng)用于EV71的檢測(cè)。本研究擬建立針對(duì)EV71-C4的逆轉(zhuǎn)錄重組聚合酶擴(kuò)增(RT-RPA)方法,并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià),以期建立一種可用于疾病暴發(fā)現(xiàn)場(chǎng)的EV71-C4的快速低成本的檢測(cè)方法。方法以毒株 SZ/HK08-6(GenBank accession no.GQ279370.1)作為參考序列,針對(duì)VP1基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針,篩選出最佳的引物和探針組合,建立EV71-C4的RT-RPA快速檢測(cè)方法,并對(duì)其靈敏度、特異度和臨床應(yīng)用可行性進(jìn)行評(píng)價(jià)。制備樣本RNA標(biāo)準(zhǔn)品,同時(shí)使用RT-RPA、RT-PCR和RT-qPCR檢測(cè)系列稀釋的樣本RNA標(biāo)準(zhǔn)品,計(jì)算并比較三種方法的95%檢測(cè)限。用柯薩奇病毒A組(CV-A2,-A4,-A5,-A6,-A9,-A10和-A16)、柯薩奇病毒B組(CV-B2,和-B4)、�？刹《�9和諾如病毒GIL17評(píng)價(jià)RT-RPA檢測(cè)方法的特異度。同時(shí)用RT-RPA、RT-PCR和RT-qPCR檢測(cè)178份疑似手足口病的臨床糞便樣本,以RT-qPCR的檢測(cè)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn),將RT-RPA和RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果與RT-qPCR的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)RT-RPA檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果本研究所建立的EV71-C4RT-RPA檢測(cè)方法,在40℃的條件下,反應(yīng)時(shí)間≤1Omin。特異度為100%,只有陽(yáng)性樣本檢測(cè)到了擴(kuò)增信號(hào),而特異性評(píng)價(jià)病毒和臨床陰性樣本均未檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)。經(jīng)概率元分析,可得RT-RPA、RT-qPCR和 RT-PCR 的 95%檢測(cè)限分別為 3.767(95%CI,3.489 to 4.283)、2.026(95%CI,1.645 to 2.710)和 4.921(95%CI,4.628 to 5.382)LGC/反應(yīng)。在臨床樣本的評(píng)價(jià)中,以RT-qPCR的檢測(cè)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn),44個(gè)份糞便樣本的檢測(cè)結(jié)果表明,RT-RPA檢測(cè)方法靈敏度和特異度均為100%,而RT-PCR的靈敏度和特異度分別為90.0%(18/20)和91.7%(22/24)�；诹硗�134個(gè)糞便樣品的測(cè)定結(jié)果表明,RT-RPA檢測(cè)方法的靈敏度和特異度分別為89.5%(68/76)和100.0%(58/58),而RT-PCR的靈敏度和特異度分別為63.2%(48/76)and 89.7%(52/58)。RT-RPA檢測(cè)方法的臨床性能與RT-qPCR無(wú)顯著性差別,但要優(yōu)于RT-PCR。結(jié)論本研究建立的針對(duì)EV71-C4的RT-RPA檢測(cè)方法,操作簡(jiǎn)單,反應(yīng)時(shí)間短,在臨床樣本的檢測(cè)中表現(xiàn)出了較高的靈敏度與特異度,適用于經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)及傳染病暴發(fā)現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。
【圖文】：

圖３－１引物擴(kuò)增效果逡逑Ｆｉｇ．３－１邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｐｒｉｍｅｒｓ逡逑線邋１：邋ＥＶ７１－Ｆ１／ＥＶ７１－Ｒ２；線邋２：邋ＥＶ７１－Ｆ１／ＥＶ７１－Ｒ１；線邋３：邋ＥＶ７１－Ｆ１／ＥＶ７１－Ｒ２逡逑的陰性對(duì)照；線４：邋ＥＶ７１－Ｆ１／ＥＶ７１－Ｒ１的陰性對(duì)照逡逑３．２靈敏度分析逡逑將樣本ＲＮＡ標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋?zhuān)芏葹椋叮矗保卞澹欤铮纾欤襄澹纾澹睿铮恚椋沐澹悖铮穑椋澹箦澹ǎ蹋牵茫┲粒欤赍义希埃矗保卞澹蹋牵茫偣灿校保矀�(gè)稀釋梯度。每種檢測(cè)方法每個(gè)稀釋梯度獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)８逡逑次，檢測(cè)結(jié)果如表３－３所示，表中記錄的數(shù)據(jù)是陽(yáng)性頻數(shù)。經(jīng)概率元分析得出逡逑ＲＴ－ＲＰＡ邋的邋９５％檢測(cè)限及邋９５％可信區(qū)間為：３．７６７邋（９５％邋ＣＩ，邋３．４８９邋ｔｏ邋４．２８３）邋ＬＧＣ／逡逑反應(yīng)。ＲＴ－ｑＰＣＲ邋９５％檢測(cè)限及邋９５％可信區(qū)間為：２．０２６邋（９５％ＣＩ，１．６４５邋ｔｏ邋２．７１０）逡逑ＬＧＣ／邋反應(yīng)。ＲＴ－ＰＣＲ邋９５％檢測(cè)限及邋９５％可信區(qū)間為邋４．９２１邋（９５％邋ＣＩ，邋４．６２８邋ｔｏ逡逑５．３８２）邋ＬＧＣ／邋反應(yīng)。逡逑表３－３不同檢測(cè)方法檢測(cè)限的比較逡逑Ｔａｂｌｅ邋３－３邋Ｃｏｍａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ａｓｓａｓ逡逑

３．３特異度分析逡逑檢測(cè)結(jié)果表明，在特異性評(píng)價(jià)中，只有陽(yáng)性對(duì)照有擴(kuò)增信號(hào)，而特異度評(píng)逡逑價(jià)病毒株均未檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)（圖３－２）。逡逑２０．０００邐一－＾ 邐＊逡逑＾邋１６，０００邋／逡逑§邋１２．０００邋／逡逑ｇ邐／逡逑Ｓ邋８．０００邐／逡逑４．０００邐／逡逑ｙ邐２－ｉ３逡逑0，000逡逑０．００邐４．００邐８．００邐１２，００邐１６．００邐２０．００邐２４．００邐２８．００邐３２．００邐３６．００邐４０．００逡逑Ｃｙｃｌｅ逡逑Ｆｉｇ．３－２邋Ｔｈｅ邋Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ邋ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＥＶ７１邋ＲＴ－ＲＰＡ邋ａｓｓａｙ逡逑圖３－２邋ＥＶ７１邋ＲＴ－ＲＰＡ檢測(cè)方法的特異度評(píng)價(jià)逡逑１：陽(yáng)性對(duì)照；２－１３：柯薩奇病毒Ａ組（ＣＶ－Ａ２，－４，－５，－６，－９，，－１０，和－１６），柯薩逡逑奇病毒ＡＳ（ＣＶ－Ｂ２，和－４），�？刹《荆�，諾如病毒ＧＩＩ．１７，陰性對(duì)照．逡逑３．４臨床應(yīng)用初步評(píng)價(jià)逡逑為了評(píng)估本實(shí)驗(yàn)建立的ＥＶ７１－Ｃ４邋ＲＴ－ＲＰＡ檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用性能，對(duì)１７８逡逑份疑似手足口病病人的糞便樣本同時(shí)用ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＴ－ＲＰＡ三種檢測(cè)逡逑３１逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R725.1;R440

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 劉志芳;桂娟娟;華啟航;董長(zhǎng)征;;人腸道病毒71型與手足口病的分子流行病學(xué)及其分子進(jìn)化[J];遺傳;2015年05期

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本文編號(hào)：2650254