【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是全球最嚴(yán)重的人獸共患病之一,嚴(yán)重危害人類身體健康,給全球公共衛(wèi)生安全帶來嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。自1882年德國科學(xué)家Koch揭示了結(jié)核分枝桿菌分離株(Mycobacteriumtuberculosis)是結(jié)核病的病原菌,開啟了對結(jié)核病深入研究。結(jié)核分枝桿菌分離株是一種體積微小,為桿狀的革蘭陽性菌,無鞭毛、無芽孢。通過抗酸染色法(acid-fast stain)可以檢測出病樣中是否存在結(jié)核分枝桿菌分離株。在臨床上,結(jié)核分枝桿菌分離株主要感染人的肺部,患者往往表現(xiàn)出劇烈的咳嗽,并伴有痰或者血絲、身體無力、胸口疼痛、低燒、盜汗等癥狀。根據(jù)世界衛(wèi)生組織報道,2016年全球新發(fā)結(jié)核病人約1040萬,TB/HIV雙重感染約為103萬,MDR-TB感染患者60萬,并列出了 2016年全球有14個國家同時面臨著TB、TB/HIV和MDR-TB的挑戰(zhàn),其中包括中國。因此,對結(jié)核分枝桿菌分離株臨床診斷、藥物治療和結(jié)核病防控,成為我國重大傳染病防控工作中的重中之重。本研究以揚州市結(jié)核病作為研究對象,對結(jié)核分枝桿菌分離株進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和藥敏試驗;采用MLVA分子分型方法研究揚州市結(jié)核分枝桿菌分離株的基因型特點,分析基因型與耐藥、性別、年齡和時間上是否有潛在的相關(guān)性;基于全基因組序列對結(jié)核分枝桿菌分離株進(jìn)行譜系分析、耐藥性預(yù)測并對其預(yù)測的結(jié)果準(zhǔn)確性進(jìn)行評估。1揚州市結(jié)核分枝桿菌分離株流行病學(xué)研究從人口分布上看,揚州市結(jié)核病患者中男性多于女性,流動人口超過本地人口的1.5倍。在年齡分布上,在35歲以下和60歲以上,女性患者比其他年齡階段人數(shù)要多,呈現(xiàn)出“雙峰”現(xiàn)象。在職業(yè)分布方面,結(jié)核病患者主要集中在農(nóng)民、離退休人員、家政服務(wù)人員這三個職業(yè),以農(nóng)民居多。從時間分布上看,揚州市結(jié)核病主要流行于春夏兩個季節(jié)。對揚州市收集的327例臨床菌株,采用PNB/TCH檢測法和多位點PCR兩種方法鑒定出311株為結(jié)核分枝桿菌分離株,16株為非結(jié)核分枝桿菌分離株,其中包括1株M.canettii和1株M.africanum subtype I。對176株結(jié)核分枝桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗,有76株菌株表現(xiàn)耐藥,總體耐藥率為43.18%,比全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查高出1.08個百分點,說明揚州市分離株總體耐藥水平較高,復(fù)發(fā)患者比新患者更容易出現(xiàn)耐藥情況。從細(xì)菌學(xué)方面看,涂陰培陽菌株具有很高的耐藥性風(fēng)險,要重視對涂陰培陽患者藥物敏感性試驗,及時準(zhǔn)確診斷,防止產(chǎn)生耐藥性。2揚州市結(jié)核分枝桿菌分離株的MLVA研究采用24個MIRU-VNTR基因位點對收集的揚州市325株結(jié)核分枝桿菌分離株進(jìn)行分子分型研究,發(fā)現(xiàn)有11株結(jié)核分枝桿菌分離株為混合感染菌株。對314株單一型的結(jié)核分枝桿菌分離株進(jìn)行VNTR基因位點重復(fù)次數(shù)分析,發(fā)現(xiàn)不同菌株對不同VNTR基因位點都存在偏好性。通過計算,成簇率為11.46%,并對成簇菌株可能存在傳染性風(fēng)險因素進(jìn)行分析,使得走訪調(diào)查具有導(dǎo)向性。同時對24個MIRU-VNTR基因位點多態(tài)性進(jìn)行了分析,計算出高分辨力位點有Mtub21和 QUB11b;中分辨力位點有 Mtub04、MIRU40、MIRU10、MIRU16、MIRU26、MIRU31;ETRE、QUB26、QUB4156、MIRU39和ETRA,這12個位點更適合作為揚州市的結(jié)核分枝桿菌分離株分子分型研究。與相關(guān)國際數(shù)據(jù)庫比較發(fā)現(xiàn)揚州市結(jié)核分枝桿菌分離株基因型具有明顯的聚集性,具有一定的保守性。3揚州市結(jié)核分枝桿菌分離株的全基因組測序初步分析從揚州市臨床分離株中選取94株結(jié)核分枝桿菌分離株進(jìn)行全基因組測序,獲取全基因組序列,并對每株結(jié)核分枝桿菌分離株的全基因組進(jìn)行耐藥性預(yù)測。通過與藥敏試驗結(jié)果比較,一致率都超過了 70%,其中對INH、RFP、EMB、SM四種一線抗結(jié)核藥物一致率分別為:82.56%、95.24%、86.90%和 86.90%,對 CPM、AK、PAS、LVFX 四種二線抗結(jié)核藥物一致率分別為:92.86%、91.67%、94.40%、73.81%。這也表明了基于全基因組序列對臨床分離株的耐藥性預(yù)測準(zhǔn)可靠性較高,但是對LVFX的耐藥性預(yù)測可靠性不高。利用核心SNVs數(shù)據(jù)庫對揚州市94株結(jié)核分枝桿菌全基因序列進(jìn)行譜系分析,84株菌株為Lineage2、10株菌株為Lineage4,其中以Lineage2為揚州市主要的譜系,而這些Lineage 2的菌株又都為北京家族。基于全基因組序列對94株結(jié)核分枝桿菌分離株進(jìn)行聚類分析,其結(jié)果與譜系分析結(jié)果一致。
【圖文】：

因邋ＴＢ／ＨＩＶ邋雙重感染死亡的人數(shù)邋３７邋萬；ＭＤＲ－ＴＢ（ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ邋ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，耐多藥逡逑結(jié)核�。┗颊呒s６０萬，死亡２４萬（ＷＨＯ．，邋２０１７）。全球有１４個國家同時面臨著ＴＢ、ＴＢ／ＨＩＶ逡逑和ＭＤＲ－ＴＢ的挑戰(zhàn)（圖１）。逡逑ＴＢ逡逑Ｃａｍｉｊｏｄｉａ＊１逡逑Ｓｉｅｒｒａ邋ｌｅｏｎｅ＊逡逑Ｓａｎｏｌａｄｅｓｈ邐Ｂｒｓａｌｌ逡逑Ｓ＾Ｋｏｆｅａ邐Ｃｅｎｔｒａｌ邋Ａｆｒｋａｎ邋ＲｅｐｕＮｋ１１邋？逡逑Ｐａｋｉｓｔａｎ邐＿／＾＊＊＂＂＊＊＼邐Ｃｏｎｇｏ＊逡逑Ｐｆｊｔｉｉｐｐｉｎｅｓ邐／邋Ｘ邐Ｌｅｓｏｔｈｏ４逡逑；：Ｒｕｓｓｉａ邋ｆｅｄｅｒａｔｌａｆｙ＾邋Ａｎｇｅｌａ邋＼邐Ｌｉｂｅｒｉａ４逡逑Ａｚｅｒｂａｉｊａｎ邐Ｖｉｅｔ邋Ｎａｍ邋／邋Ｃｈｍａ邋＼邋Ｎａｍｉｂｉａ＊逡逑Ｂｅｉａｒｕｓ邐／邋ＤＲＣｏｏ＾ｏ邋Ｖ邋ＵＲＴａｎｚａｔｉｉａ邐Ｂｏｔｓｗａｎａ逡逑Ｋａｚａｋｈｓｔａｎ邐ｔｔｈｓｏ＾ａ邐＼邐Ｚａｍｂｉａ？邐Ｃａｍｅｒｏｏｎ逡逑Ｖ邐＾逡逑ｉｓ？逡逑Ｕｚｂｅｋｉｓｔａｎ邐＼邋Ｓｏｕｔｈ邋Ａｆｒｉｃａ邋／逡逑＼邋Ｔｈａｉｉａｎｄ邋／逡逑＼Ｚｉｍｂｄｂｍｙ逡逑ＭＤＲ－ＴＢ邐ＴＢ／ＨＩＶ逡逑圖１邋ＴＢ、ＴＢ／ＨＩＶ和ＭＤＲ－ＴＢ氋負(fù)擔(dān)國家逡逑Ｆｉｇ邋１邋Ｈｉｇｈ－ｂｕｒｄｅｎ邋ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ邋ｌｉｓｔｓ邋ｆｏｒ邋ＴＢ，邋ＴＢ／ＨＩＶ邋ａｎｄ邋ＭＤＲ－ＴＢ逡逑

１全基因組測序技術(shù)進(jìn)展概況逡逑全基因組測序技術(shù)始于第一代ＤＮＡ測序技術(shù)即Ｓａｎｇｅｉ？法，經(jīng)過三十多年的發(fā)展，己逡逑發(fā)展到第三代（圖２）。測序的讀長也隨著技術(shù)發(fā)展由長到短，再由短到長。根據(jù)美國國逡逑立生物技術(shù)信息中心（Ｎａｔｉｏｎａｌ邋Ｃｅｎｔｅｒ邋ｆｏｒ邋Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＣＢ丨）數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，逡逑第二代短讀長測序技術(shù)在全球測序市場中占有絕對的優(yōu)勢。而第三代測序技術(shù)，彌補了第逡逑二代測序技術(shù)中的不足，對藥物研發(fā)、疾病研宄、基因組研究等方面有很大的推動作用。逡逑Ｓｉｎｇｌｅ邋ｍｏｌｅｃｕｌｅ逡逑Ｒｅａｌ邋Ｄｍｃ（ＳＭＲＴ）逡逑Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ邐（２００９）逡逑邐邋（２００８）逡逑（１９５３）邐Ｎａｎ0Ｐ0ｒＵ逡逑中心湖邐（１９Ｖ８）邐（２００Ｘ）逡逑丨中＝邐炎光＿邋！邐ｉ邐］邐１二逡逑第一臺商用邐（２０＾０）逡逑ｉｉｎｖ密碼邐ｒ丨動捎中_咤義希ǎ保梗叮叮╁危ǎ保梗福罰懼義弦弧危巍叔澹義希皺澹皺蜰邋畬邐＿N．．．．．．．．．．邋邐邐邐邐邐邐邐邐＾二逡逑■■■■■■了，嚴(yán)邐▲邐八八邋Ｉ邋Ｖ邋暴．．．．凡…一邋｜邐，，只－＾｜ｒ－ｉｉ「ｉｎ－－－－－－－ｎｉｉｒｎ邋，＇晷，逡逑Ｉ９５０ｊ邐１９６０邐１０７０邋Ｉ邋１＜）８０邐�。梗迹板濉姡玻埃埃捱姡赍澹苓姡�0ｌ0逡逑＾邐１邐毛細(xì)費電泳邐（２００５）逡逑Ｉｒｊｖ＊邋Ｉ？邋ｉｆ－邐＾Ｓａｎｇｅｒ邐Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ邐ｒ邐ＧｃＸＰ逡逑＾邐＜＿邐遍邐＾ｏ
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R446.5

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10 張健源;李傳友;趙雁林;姜廣路;劉宇紅;馬s，

本文編號：2648993