【摘要】：背景與目的腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)作為腎臟替代治療的方法之一,用于治療終末期腎病患者。與血液透析(Hemodialysis,HD)相比,PD有利于對(duì)殘余腎功能的保護(hù),且其具有對(duì)血流動(dòng)力學(xué)影響小,治療費(fèi)用相對(duì)較低,可居家操作等優(yōu)勢(shì)。而越來(lái)越多的證據(jù)表明:長(zhǎng)期接觸含高濃度葡萄糖的腹膜透析液(Peritoneal dialysis fluid,PDF)可導(dǎo)致PD患者慢性并發(fā)癥的發(fā)生,例如增加心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)的發(fā)病率,以及導(dǎo)致殘余腎功能(Residual renal function,RRF)喪失。長(zhǎng)期PD可能會(huì)使腹腔發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng),包括巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞侵入腹膜。除了高糖腹透液的影響,炎性細(xì)胞因子的釋放是腹膜結(jié)構(gòu)和功能惡化的另一個(gè)主要驅(qū)動(dòng)因素。腹膜炎以腹腔中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為特征,最終導(dǎo)致腹膜相關(guān)性腹膜炎的發(fā)生,使患者不得不退出腹膜透析治療。研究證明IL-8是中性粒細(xì)胞分泌的一種強(qiáng)有力趨化細(xì)胞因子,之前有研究表明,IL-6和IL-8等炎癥因子在腹膜炎患者的透析液中呈明顯升高的趨勢(shì)。當(dāng)PD患者置管手術(shù)和患者發(fā)生腹膜炎的時(shí)候,IL-6濃度均會(huì)明顯升高。然而,IL-8濃度只有在患者發(fā)生腹膜感染時(shí)才會(huì)升高。這些結(jié)果提示了透析液中IL-8濃度的測(cè)定可作為追蹤PD患者發(fā)生腹膜炎的特異性指標(biāo)。NF-κB作為一種常見(jiàn)轉(zhuǎn)錄因子,它可以介導(dǎo)多在不同的生物學(xué)過(guò)程中多種基因的表達(dá),包括細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞存活,以及多種免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。NF-κB也是多種主要炎癥細(xì)胞因子(如TNF-α和IL-1)刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì),從而參與炎癥的效應(yīng)期。EMT是由促纖維化和炎性刺激細(xì)胞因子觸發(fā)的,人腹膜間皮細(xì)胞(Human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)中的EMT被認(rèn)為是腹膜纖維化的早期階段。預(yù)防PD患者的EMT可減輕腹膜周圍的纖維化,從而保護(hù)腹膜間皮層。本研究的目的在于討論,高糖環(huán)境下,人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)可以通過(guò)分泌IL-8,促進(jìn)人腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT。用含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)PBMCs,收集培養(yǎng)后的上清,將其稀釋10倍,繼續(xù)培養(yǎng)HPMCs,采用Westernblot以及熒光定量PCR等方法檢測(cè)與EMT相關(guān)的標(biāo)志物。使用不同濃度以及不同時(shí)間的IL-8刺激HPMCs,觀察EMT相關(guān)標(biāo)記物的改變;以及IL-8對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響。將NF-κB特異性抑制劑PDTC加入至含IL-8的培養(yǎng)基,觀察NF-κB信號(hào)通路被阻斷之后,HPMCs的EMT過(guò)程是否受到抑制。由此我們可以得出結(jié)論,在高糖環(huán)境中,PBMCs分泌IL-8通過(guò)NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)HPMCs發(fā)生EMT,最終導(dǎo)致腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的發(fā)生。方法1.收集普通外科手術(shù)相對(duì)正常的腹膜(如膽結(jié)石,闌尾炎等疾病)以及PD腹膜超濾衰竭拔管時(shí)的腹膜組織,利用免疫組化方法,使用巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68對(duì)腹膜組織進(jìn)行染色。利用正置顯微鏡觀察組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并拍攝照片。2.用5.5mM正常糖濃度的RPMI-1640培養(yǎng)基作為對(duì)照組,和60mM高糖濃度的RPMI-1640培養(yǎng)PBMCs 24h后,收集上清液培養(yǎng)HPMCs,24h后收集總蛋白,采用Western Blot和熒光定量PCR方法檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物的蛋白及mRNA水平。3.用60mM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)PBMCs24h后,以1:10稀釋上清,并以此上清刺激HPMCs12h,24h,48h后,采用Western Blot和熒光定量PCR方法檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物的蛋白及mRNA水平。4.用5.5mM正常糖濃度的RPMI-1640培養(yǎng)基作為對(duì)照組,和60mM高糖濃度的RPMI-1640培養(yǎng)PBMCs 24h后,提取RNA,以熒光定量PCR方法檢測(cè)PBMCs中IL-8mRNA的表達(dá)水平。5.用正常培養(yǎng)基,濃度為10ng/ml和30ng/ml的IL-8分別刺激HPMCs24h,提取腹膜間皮細(xì)胞總蛋白,采用Western Blot方法檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物的蛋白表達(dá)量,包括E-cadherin,Vimentin和α-SMA蛋白的表達(dá)水平。6.用30ng/mlIL-8分別刺激HPMCs12h,24h,48h,提取細(xì)胞蛋白,采用Western Blot方法檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物的蛋白表達(dá)量。7.用正常培養(yǎng)基,濃度為10ng/ml和30ng/ml的IL-8分別刺激HPMCs24h,提取總蛋白,采用Westernblot方法,檢測(cè)NF-κBP65蛋白的磷酸化水平。8.用30ng/ml IL-8分別刺激HPMCs 12h,24h,48h,提取細(xì)胞蛋白,采用Westernblot方法,檢測(cè)NF-κBp65蛋白的磷酸化水平的改變。9.用正常培養(yǎng)基,30ng/mlIL-8,30ng/mlIL-8+1μM PDTC刺激HPMCs24h后,提取細(xì)胞總蛋白,采用Westernblot方法檢測(cè)EMT標(biāo)志物的蛋白水平的改變。結(jié)果1.使用CD68對(duì)腹膜透析超濾衰竭患者的腹膜組織進(jìn)行染色,發(fā)現(xiàn)大量CD68陽(yáng)性細(xì)胞浸潤(rùn)。2.以60mM的葡萄糖濃度刺激PBMC24h,收集上清液稀釋后培養(yǎng)HPMCs,24h后收集總蛋白,Western Blot顯示:與對(duì)照組及5.5mM葡萄糖濃度組相比,E-cadherin的蛋白和mRNA表達(dá)水平降低,α-SMA和Vimentin的蛋白及mRNA表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*#P0.05)。3.以60mM的葡萄糖濃度刺激PBMCs24小時(shí)后,收集上清液稀釋后培養(yǎng)HPMCs12h,24h,48h,提取總蛋白,WesternBlot結(jié)果顯示:隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng),上皮表型E-cadherin的蛋白表達(dá)水平逐漸下調(diào),間質(zhì)表型蛋白α-SMA以及波形蛋白Vimentin的蛋白表達(dá)水平逐漸上調(diào)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05)。4.分別用正常培養(yǎng)基和60mM葡萄糖培養(yǎng)基刺激PBMCs24h后,提取細(xì)胞RNA,采用熒光定量PCR方法檢測(cè)得出:60mM的葡萄糖刺激PBMCs24h后,IL-8的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05)。5.當(dāng)IL-8的刺激濃度逐漸升高,E-cadherin的蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。間質(zhì)表型蛋白α-SMA和波形蛋白Vimentin的蛋白表達(dá)水平呈逐漸上調(diào)的趨勢(shì)。(*P0.05)。6.用30ng/ml IL-8分別刺激HPMCs 12h,24h,48h,提取細(xì)胞蛋白,Western Blot結(jié)果顯示:隨著IL-8刺激時(shí)間的延長(zhǎng),上皮表型蛋白E-cadherin的蛋白表達(dá)量逐漸下調(diào);相反,間質(zhì)表型蛋白α-SMA和Vimentin的蛋白表達(dá)水平呈逐漸上調(diào)的趨勢(shì)(*P0.05)。7.隨著IL-8刺激濃度的升高,NF-κBP65蛋白的磷酸化水平成逐漸上調(diào)的趨勢(shì)(*P0.05)。8.隨著30ng/mlIL-8刺激時(shí)間的延長(zhǎng),NF-κBP65蛋白的磷酸化水平逐漸升高(*P0.05)。9.阻斷NF-κB信號(hào)通路后,Westernblot結(jié)果顯示,抑制劑PDTC組的Ecadherin表達(dá)相較于IL-8刺激組,明顯上調(diào);而α-SMA和Vimentin的蛋白表達(dá)量下調(diào)(*P0.05)。結(jié)論1.高糖刺激PBMCs可間接誘導(dǎo)HPMCs發(fā)生EMT。2.PBMCs可以分泌IL-8,促進(jìn)HPMCs的EMT過(guò)程。且隨著IL-8濃度和時(shí)間的延長(zhǎng),EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)上調(diào)。3.IL-8可通過(guò)NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)HPMCs發(fā)生EMT。
【圖文】：

21正常 腹膜超濾衰竭圖 1 腹膜組織中巨噬細(xì)胞標(biāo)記蛋白 CD68 的表達(dá)糖刺激的 PBMCs 可誘導(dǎo) HPMCs 發(fā)生 EMT高糖環(huán)境中 PBMCs 對(duì) HPMCs EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響分別以 5.5mM 葡萄糖濃度的培養(yǎng)基和 60mM 葡萄糖濃度的培養(yǎng)基刺激C24h，收集上清液培養(yǎng) HPMCs，24h 后收集總蛋白，采用 Western B測(cè)細(xì)胞的蛋白表達(dá)量，其結(jié)果提示：與正常對(duì)照組和 5.5mM 正常葡萄激組相比，60mM 葡萄糖刺激組的上皮表型 E-cadherin 蛋白表達(dá)水平明，間質(zhì)表型 α-SMA 以及波形蛋白 Vimentin 的蛋白表達(dá)水平明顯升高,

圖 2 高糖環(huán)境中 PBMCs 對(duì) HPMCs EMT 蛋白標(biāo)志物表達(dá)的影響A .E-cadherin，Vimentin，α-SMA 在細(xì)胞中的表達(dá)情況B. E-cadherin，Vimentin，α-SMA 的相對(duì)表達(dá)水平（*#P<0.05）2.2 高糖環(huán)境中 PBMCs 對(duì) HPMCs EMT 標(biāo)志物 mRNA 表達(dá)的影響以 5.5mM 葡萄糖培養(yǎng)基和 60mM 葡萄糖濃度培養(yǎng)基刺激 PBMC24h，收集上清液培養(yǎng) HPMCs，24h 后提取細(xì)胞 RNA，，熒光定量 PCR 結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組及 5.5mM 葡萄糖濃度組相比，60mM 葡萄糖刺激組的上皮表型 E-cadherin的 mRNA 表達(dá)降低（圖 3A），間質(zhì)表型蛋白 α-SMA 以及波形蛋白 Vimentin 的mRNA 表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。n=3,*#P<0.05（圖 3B、3C）。而正常對(duì)照組與 5.5mM 葡萄糖濃度組的差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。n=3, *#P>0.05。APDHPDHPDH
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R692.5

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10 董U

本文編號(hào)：2647710