【摘要】：目的:建立直接鑒定陽(yáng)性血培養(yǎng)或固體培養(yǎng)基分離陽(yáng)性標(biāo)本中金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)的分子信標(biāo)(Molecular Beacon,MB)熒光原位雜交方法,通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行識(shí)別,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)SA的快速檢測(cè),并評(píng)估該方法的臨床應(yīng)用。方法:針對(duì)SA的16S rRNA基因序列,合成三條特異性分子信標(biāo)探針(MB1、MB2和MB3),其中MB1和MB2為本研究設(shè)計(jì),MB3為文獻(xiàn)報(bào)道的SA探針,對(duì)三條探針的信噪比(S/N值)和熱變性曲線(xiàn)等進(jìn)行評(píng)估,篩選出最佳探針。對(duì)雜交體系的優(yōu)化包括分子信標(biāo)濃度(0μmol/L~2μmol/L)、MgCl_2濃度(0mmol/L~7mmol/L)以及去離子甲酰胺濃度(0%~55%)等。設(shè)計(jì)多條與篩選出的分子信標(biāo)不匹配基因序列,通過(guò)熱變性曲線(xiàn)和熒光導(dǎo)數(shù)曲線(xiàn)篩選最佳雜交溫度。優(yōu)化溶葡萄球菌素透化處理SA細(xì)胞壁的濃度(0U/mL~20U/mL)。采用該雜交體系檢測(cè)陽(yáng)性血培養(yǎng)或固體培養(yǎng)基分離的10種臨床常見(jiàn)菌株及標(biāo)準(zhǔn)菌株(革蘭氏陽(yáng)性球菌),通過(guò)熒光顯微鏡識(shí)別熒光信號(hào),評(píng)價(jià)該雜交體系對(duì)SA檢測(cè)的特異性。利用SA標(biāo)準(zhǔn)菌株,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)陰性空白SA菌液及分子信標(biāo)SA菌液,統(tǒng)計(jì)兩組平均熒光強(qiáng)度差異。以陰性空白SA菌液、分子信標(biāo)雜交SA菌液及非特異性熒光染料PI染色SA菌液為對(duì)照,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)200份血培養(yǎng)標(biāo)本待測(cè)陽(yáng)性球菌,與傳統(tǒng)的表型鑒定方法比較,評(píng)價(jià)該雜交體系檢測(cè)SA的特異性和靈敏度。結(jié)果:設(shè)計(jì)、合成的MB1的S/N值均高于MB2和MB3的S/N值(均P0.001)。不同濃度下MB1S/N值均大于20,MB1的熱變性曲線(xiàn)結(jié)果顯示在溫度低于50℃熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定(接近本底熒光),在50℃~65℃熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),大于65℃熒光強(qiáng)度逐漸減弱。建立的MB1雜交體系為:1.4μmol/L MB1、2.5 mmol/L MgCl_2、25%去離子甲酰胺。當(dāng)溫度低于45℃時(shí)MB1可區(qū)分兩個(gè)堿基不匹配基因序列,當(dāng)溫度在45~50℃可區(qū)分單堿基不匹配基因序列,溫度高于50℃影響MB1穩(wěn)定性。SA細(xì)胞壁最佳透化條件為:7.5 U/ml溶葡萄球菌素作用5 min;優(yōu)化后的雜交體系與陽(yáng)性血培養(yǎng)或固體培養(yǎng)基分離的臨床菌株及標(biāo)準(zhǔn)菌株雜交,在熒光顯微鏡下僅有SA產(chǎn)生熒光信號(hào),其余均未見(jiàn)熒光。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分子信標(biāo)雜交SA菌液平均熒光強(qiáng)度(11.47±2.27)高于陰性SA菌液的平均熒光強(qiáng)度(1.71±0.59),P0.001。該方法檢測(cè)200份血培養(yǎng)標(biāo)本中待測(cè)陽(yáng)性球菌,對(duì)SA檢測(cè)的特異性和靈敏度分別為100%和95.83%,與傳統(tǒng)的表型鑒定方法相比具有極強(qiáng)的一致性(Kappa值=0.967)。結(jié)論:(1)基于分子信標(biāo)熒光原位雜交方法可通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀實(shí)現(xiàn)血培養(yǎng)陽(yáng)性或固體培養(yǎng)基分離的SA快速鑒定。(2)基于分子信標(biāo)熒光原位雜交方法應(yīng)用于血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中SA的檢測(cè),特異性和靈敏度高,與傳統(tǒng)的表型鑒定方法比較具有極強(qiáng)的一致性。
【圖文】：

圖 1 分子信標(biāo)工作原理總之，SA 是人類(lèi)感染性疾病的重要致病菌之一，快速、及時(shí)的檢測(cè)病原菌是控制SA 感染和改善患者預(yù)后的重要環(huán)節(jié)。但是，無(wú)論是傳統(tǒng)基于培養(yǎng)技術(shù)的表型鑒定方法，還是不斷開(kāi)發(fā)的新技術(shù)，，均不是理想的 SA 鑒定方法。本課題針對(duì) SA 的 16S rRNA 基因序列，設(shè)計(jì)、合成特異性分子信標(biāo)探針，構(gòu)建基于分子信標(biāo)熒光原位雜交體系直接鑒定陽(yáng)性血培養(yǎng)或固體培養(yǎng)基分離陽(yáng)性標(biāo)本，通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行識(shí)別，從而實(shí)現(xiàn)對(duì) SA 的快速檢測(cè)，并評(píng)估該方法的臨床應(yīng)用。

主；（4）用接種環(huán)在固體培養(yǎng)基上取單個(gè)菌落，將其置于潔凈的玻片上，然后滴加 1滴觸酶試驗(yàn)試劑并立即觀察結(jié)果。菌落與觸酶試劑反應(yīng)產(chǎn)生大量氣泡者為陽(yáng)性，反之為陰性。SA 觸酶試驗(yàn)為陽(yáng)性；（5）對(duì)觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性的菌落進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)，取兔血漿及鹽水各 1 滴，分別置于潔凈玻片上。然后用接種環(huán)取疑似菌落并分別與鹽水及血漿混合。10 秒內(nèi)觀察結(jié)果，如血漿中有明顯顆粒出現(xiàn)，而鹽水中無(wú)自凝現(xiàn)象者為陽(yáng)性。SA 血漿凝固酶試驗(yàn)為陽(yáng)性。（6）鑒定：從哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上挑取單個(gè)純菌落，按照 VITEK-Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥物敏感分析系統(tǒng)操作要求對(duì)菌落進(jìn)行鑒定。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R446.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2646687