【摘要】：研究目的:構(gòu)建Tn917轉(zhuǎn)座子突變文庫,通過血漿凝集實驗及動態(tài)比濁法篩選及鑒定促凝相關(guān)基因,并通過對篩選基因進(jìn)行驗證。構(gòu)建金黃色葡萄球菌泛醌細(xì)胞色素氧化酶A亞基基因缺失突變株,對其生物學(xué)功能進(jìn)行初步探討;方法:1.利用帶有轉(zhuǎn)座子Tn917的溫度敏感性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至RN4220進(jìn)行修飾后,再轉(zhuǎn)入Newman標(biāo)準(zhǔn)菌株中,通過紅霉素和高溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子隨機插入金黃色葡萄球菌中,引起隨機突變建立金葡菌轉(zhuǎn)座子突變文庫,通過試管凝集實驗及動態(tài)濁度法對細(xì)菌促進(jìn)血漿凝集能力進(jìn)行篩選;使用抗性標(biāo)記挽救法篩選出相應(yīng)影響的突變基因并應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測基因的功能。2.采用基因敲除技術(shù)對所篩選到的基因進(jìn)行驗證:通過融合PCR連接目的基因上下同源片段,使用基于位點特異性重組的Gateway克隆技術(shù)導(dǎo)入溫度敏感性質(zhì)粒PKOR1,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌修飾缺陷型DC10B獲得同源重組質(zhì)粒,并將該質(zhì)粒導(dǎo)入Newman菌株中,在氯霉素和高溫下多次傳代,再通過脫水四環(huán)素反向篩選,采用基因組PCR和測序技術(shù)鑒定突變株。通過試管凝集實驗及動態(tài)濁度法對細(xì)菌促進(jìn)血漿凝集能力進(jìn)行鑒定;3.通過細(xì)菌生長曲線測定、抗氧化實驗、生物被膜形成實驗及動物實驗等對泛醌細(xì)胞色素氧化酶基因功能進(jìn)行初步探索;結(jié)果:1.成功構(gòu)建了庫容量約為2×10~5轉(zhuǎn)座子突變文庫,通過觀察促進(jìn)血漿凝集能力共計篩選到499株凝集減弱或消失的突變菌株。對其中85株進(jìn)行轉(zhuǎn)座子插入位點進(jìn)行鑒定,確認(rèn)其中的76個突變菌株的轉(zhuǎn)座子插入位點,涉及基因13個,包括已經(jīng)報道的與促凝集相關(guān)基因4個。2.對其中促凝集能力明顯降低且未報道的基因進(jìn)行敲除驗證,證實泛醌細(xì)胞色素氧化酶A亞基(cydA)突變后,細(xì)菌不能促使血漿凝集。3.cydA基因缺失株在有氧條件下生長并未受明顯影響,細(xì)菌溶血能力明顯減弱,抗氧化能力明顯下降,但對生物被膜的形成沒有明顯影響。在皮膚膿腫模型中,突變株所形成潰瘍面積明顯減少。菌血癥模型中,突變株小鼠生存時間明顯延長,預(yù)后良好。實時熒光定量PCR檢測相關(guān)毒力因子表達(dá)明顯降低。結(jié)論:本實驗構(gòu)建的轉(zhuǎn)座子突變文庫可用于細(xì)菌特定表型相關(guān)基因的篩查,除已知影響金葡菌促進(jìn)血漿凝集能力外篩查并證實了泛醌細(xì)胞色素氧化酶A亞基突變后會顯著影響血漿凝集。cydA基因在金葡菌致病過程中具有不可或缺的作用,有望作為新的疫苗的靶點。
【圖文】：

轉(zhuǎn)座子插入位點示意圖

圖 1 凝集能力降低或無凝集能力試管反應(yīng)圖Figure 1 A map of reduced or non agglutinating ability注：A：完全凝聚；B：凝聚減弱；C：不凝聚.mplete agglutination; B: Decreased agglutination; C: No
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R440

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2637370