發(fā)布時間：2020-04-22 22:58

【摘要】：背景膿毒癥每年全球發(fā)病人數(shù)約有2700-3000萬人,死亡人數(shù)仍高達700-900萬。膿毒癥目前仍缺乏有效的治療手段。近年來,隨著干細胞研究的深入,干細胞治療膿毒癥取得了良好的效果,但其作用機制并不是通過其分化增殖來替代壞死細胞;而是依靠其旁分泌功能,通過免疫調節(jié)糾正機體失衡的免疫功能,從而發(fā)揮治療作用。另外,干細胞治療存在致癌風險、錯過最佳治療窗口、到達患處細胞數(shù)量少等缺點。再生實驗研究表明,外泌體是干細胞發(fā)揮其旁分泌功能的重要物質載體。外泌體利用其內容物使得靶細胞重編程,進而發(fā)揮其調控作用。其中mi RNA是外泌體主要藥效分子之一。近來有研究表明,NO誘導的富含mi R-126的胎盤間充質干細胞外泌體具有促進損傷血管再生修復的作用,而血管內皮損傷和DIC是膿毒癥重要病理機制。因此,提出假設:NO誘導的富含mi R-126的胎盤間充質干細胞外泌體具有治療膿毒癥的作用。本實驗試圖通過構建膿毒癥大鼠模型,驗證外泌體的治療作用,同時探索其可能的藥理機制。研究目的1、第一部分:首先對胎盤間充質干細胞分離培養(yǎng),對其進行NO誘導,進而從條件培養(yǎng)基中富集三種不同外泌體,進行鑒定、比較,為后續(xù)實驗提供材料。2、第二部分:建立大鼠膿毒癥模型,研究富含mi R-126的外泌體對膿毒癥大鼠的治療效果,并探索其可能的藥理機制。實驗方法1、第一部分:臨床獲取健康的胎盤,選擇酶消化法進行人胎盤間充質干細胞(hp-MSC)的培養(yǎng)和傳代;取第4代hp-MSC,利用NO、mi R-126抑制劑及無效對照抑制對其進行誘導培養(yǎng),通過超速離心法獲取3種外泌體(N-Exo、I-Exo和Exo);利用透射電鏡觀察對比外泌體形態(tài),利用Western Blot法檢測外泌體表面標志分子;利用q RT-PCR檢測和對比三種外泌體mi R-126-3p和-5p的含量,從而全面鑒定外泌體,并比較三者間的差異。2、第二部分:建立膿毒癥大鼠模型,并分為四組:對照組(C組,假手術+PBS)、膿毒癥組(S組,CLP+PBS)、Exo治療組(N組,CLP+N-Exo)、I-Exo治療組(I組,CLP+I-Exo)。建模后48h,檢測各組大鼠血肝腎功能指標(ALT、AST、BUN)、炎癥因子(IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-1β);取肺、腎HE染色,并做病理評分;測量肺和腎血管微滲漏及干/濕重之比;利用q PCR檢測各組大鼠腎臟mi R-126-3p及-5p含量,利用western blot檢測腎臟內HMGB1、RAGE、TRL-2、TRL-4、p-p65蛋白含量。最終,觀察并統(tǒng)計四組大鼠的7天存活率。結果1、第一部分:三種外泌體均為圓形膜囊泡,形態(tài)上無顯著差異;N-Exo的平均粒徑大小為70.9±5.3nm;Exo為71.5±4.4nm,I-Exo為72.3±5.1nm,三種外泌體粒徑比較無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05);三種外泌體均高表達CD9和CD63,幾乎不表達Tubulin;三種外泌體中mi R-126的含量具有顯著的統(tǒng)計學差異(P0.05),I-ExoExoN-Exo。2、第二部分:(1)各組大鼠的七天存活率:S組和I組間無顯著的統(tǒng)計學差異(P0.05),但均顯著低于N組和C組(P0.05);(2)術后48h,肝腎功能及炎癥因子含量、肺和腎病理評分、血管微滲漏及干/濕重之比:S組和I組、N組和C組間無顯著的統(tǒng)計學差異(P0.05),但S組和I組顯著高于N組和C組(P0.05);(3)各組腎臟內mi R-126-3p和-5p的含量:S組和I組、N組和C組間無顯著的統(tǒng)計學差異(P0.05),但S組和I組顯著低于N組和C組(P0.05);(4)各組腎臟內HMGB1、RAGE、TRL-2、TRL-4、p-p65蛋白含量:S組和I組、N組和C組間無顯著的統(tǒng)計學差異(P0.05),但S組和I組顯著高于N組和C組(P0.05)。結論1、本研究成功培養(yǎng)誘導了三種不同的胎盤間充質干細胞外泌體,同時對其進行了鑒定對比,NO能明顯提高干細胞外泌體中mi R-126含量。2、N-Exo可能是通過mi R-126的輸注,降低了膿毒癥大鼠HMGB1的水平,進而通過受體信號的轉導,抑制NF-κB激活,進而抑制多種炎癥因子的釋放,并緩解炎癥反應,保護重要器官的功能,最終提高膿毒癥大鼠的存活率。
【圖文】：

圖 1 外泌體透射電鏡照片顯示，3 種外泌體均為直徑約為 70nm 的圓形如圖 1）徑分布圖 2 三種外泌體粒徑分布圖儀，，分別測得三種外泌體（Exo、N-Exo、I-Exo 的平均粒徑大小為 70.9±5.3nm；Exo 的平的平均粒徑大小為 72.3±5.1nm，三者間無

25圖 2 三種外泌體粒徑分布圖利用激光散射儀，分別測得三種外泌體（Exo、N-Exo、I-Exo）的粒徑分布圖，如圖 2 所示。N-Exo 的平均粒徑大小為 70.9±5.3nm；Exo 的平均粒徑大小為 71.5±4.4nm，I-Exo 的平均粒徑大小為 72.3±5.1nm，三者間無顯著的統(tǒng)計學差異（P>0.05），三種外泌體絕大部分粒徑均介于 55-85nm 之間。3.1.3 外泌體的表面標志物
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R459.7

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本文編號：2637063