【摘要】：目的:獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)引起的一種傳染性疾病,抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(Antiretroviral Therapy,ART)的出現(xiàn)大大降低了HIV感染者的發(fā)病率和死亡率,但在ART治療后免疫恢復(fù)情況在HIV感染人群中存在很大差異,大多數(shù)人在治療后1-2年免疫系統(tǒng)功能得到一定程度恢復(fù),CD4+T細(xì)胞水平明顯升高,病毒載量得到有效控制,稱免疫應(yīng)答者(Immunological Responders,IR)。但有些患者在抗病毒治療后1-2年甚至更長(zhǎng)的時(shí)間,免疫細(xì)胞的功能未得到有效恢復(fù),CD4+T細(xì)胞水平無(wú)明顯升高甚至降低,病毒載量未得到有效控制,稱為免疫無(wú)應(yīng)答者(Immunological Nonresponders,INR),免疫無(wú)應(yīng)答者的發(fā)病率及死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于應(yīng)答者,為改善艾滋病抗病毒治療效果,降低病死率,明確免疫無(wú)應(yīng)答機(jī)制對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸具有重要意義。HIV感染后腸道上皮細(xì)胞損傷和大量微生物移位,引起免疫系統(tǒng)的持續(xù)性活化及高炎性應(yīng)答狀態(tài)是導(dǎo)致HIV感染疾病進(jìn)展和預(yù)后不良的重要原因。目前,抗病毒治療雖然能夠降低炎性反應(yīng),但不能將其控制在正常水平,炎性因子持續(xù)分泌,導(dǎo)致免疫細(xì)胞的衰老和耗竭,影響抗病毒治療效果,降低HIV感染者的生活質(zhì)量。研究顯示,抗病毒治療后持續(xù)炎癥狀態(tài)是免疫無(wú)應(yīng)答的重要原因,探索INR的免疫機(jī)制,深入了解炎癥應(yīng)答過(guò)程中免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制有助于控制機(jī)體過(guò)度炎癥反應(yīng)狀態(tài),為HIV功能性治愈的提供新的治療靶點(diǎn)。單核細(xì)胞作為HIV感染后參與免疫應(yīng)答的關(guān)鍵免疫細(xì)胞,在HIV抗病毒治療后IR、INR的單核細(xì)胞亞群分布目前尚無(wú)報(bào)道。單核細(xì)胞發(fā)揮炎性應(yīng)答需要大量的能量供給,活化后其代謝狀態(tài)由有氧氧化向糖酵解轉(zhuǎn)變,而異常的糖代謝狀態(tài)是影響HIV疾病進(jìn)展與轉(zhuǎn)歸的重要因素。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Glucose transporter 1,Glut1)是細(xì)胞糖代謝的關(guān)鍵分子。因單核細(xì)胞在HIV感染后長(zhǎng)期處于慢性活化狀態(tài),糖攝取增加,研究顯示,HIV感染后Glut1在單核細(xì)胞表面表達(dá)增加,ART治療后未恢復(fù)至正常水平,但Glut1在INR、IR單核細(xì)胞各亞群的表達(dá)情況尚無(wú)報(bào)道。本研究首次對(duì)ART后免疫恢復(fù)效果不同的患者單核細(xì)胞亞群分布及Glut1的表達(dá)情況進(jìn)行分析,探索單核細(xì)胞表面Glut1與免疫恢復(fù)的關(guān)系以及對(duì)炎性因子分泌的影響。機(jī)體免疫系統(tǒng)中,炎性細(xì)胞因子的主要來(lái)源是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng),同時(shí)炎性因子的分泌是單核細(xì)胞發(fā)揮炎性應(yīng)答的重要手段。IP-10是一種干擾素誘導(dǎo)蛋白(Interferon-inducible protein-10,IP-10),由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等分泌的促炎性細(xì)胞因子。HIV感染后IP-10的分泌明顯增加,血漿IP-10濃度不僅與HIV感染早期疾病快速進(jìn)展有關(guān),與機(jī)體持續(xù)的免疫活化也密切相關(guān)。另外IP-10作為HIV感染的標(biāo)志性因子,血漿中高水平IP-10是單核細(xì)胞發(fā)揮炎性應(yīng)答的重要途徑。明確IP-10的調(diào)控機(jī)制,有效控制單核細(xì)胞的炎癥應(yīng)答及IP-10分泌,對(duì)于探索新的干預(yù)手段和治療策略具有重要意義。免疫系統(tǒng)的異常活化以及某些炎癥因子的過(guò)度分泌與INR有關(guān),單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)是炎性因子的主要來(lái)源,探索單核細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響因素,有助于深入了解HIV免疫恢復(fù)的調(diào)節(jié)機(jī)制,為控制機(jī)體過(guò)度炎癥應(yīng)答提供新思路。研究方法:1.研究對(duì)象論文第一部分共收集28例樣本,HIV感染者19例,治療時(shí)間為18-24個(gè)月,治療前CD4+T細(xì)胞數(shù):200 500 cells/μL,篩選出HIV感染抗病毒治療后免疫應(yīng)答者(IR,n=9)治療后檢測(cè)點(diǎn)的CD4+T細(xì)胞數(shù)高于治療前(30%),免疫無(wú)應(yīng)答者(INR,n=10)治療后檢測(cè)點(diǎn)的CD4+T細(xì)胞數(shù)低于治療前(20%),呈不斷降低的趨勢(shì),或經(jīng)治療后CD4+T細(xì)胞無(wú)明顯的增加。健康對(duì)照(Healthy Control,HC,n=9)。論文第二部分共申請(qǐng)HIV感染者(HIV,n=32)和健康對(duì)照(HC,n=35)共67例血漿樣本,凍存于-80℃。2.原代細(xì)胞的分選和單核細(xì)胞亞群檢測(cè)密度梯度離心法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),首先提取全血的PBMC,采用BD FACS Aria流式細(xì)胞儀分選以CD14(PE-Cy7)和CD16(APC-Cy7)兩抗體將單核細(xì)胞分為三個(gè)亞群,classical[C]:CD14++CD16-,intermeidate[I]:CD14++CD16+,nonclassical[NC]:CD14+CD16+。4℃避光染色30min,離心洗滌細(xì)胞,棄上清,使用流式細(xì)胞儀LSRⅡ及Flowjo軟件(BD)進(jìn)行單核細(xì)胞亞群和Glut1(PE)(RD Systems)表達(dá)的分析。3.THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)及THP-1-MA的誘導(dǎo)培養(yǎng)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株(THP-1)培養(yǎng)于含有10%FBS的RPMI 1640(HyClone)。佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA,100 ng/m L;Sigma)處理THP-1細(xì)胞48h,誘導(dǎo)THP-1分化為T(mén)HP-1 macrophage(THP-1-MA)。4.轉(zhuǎn)染siRNA將siRNA-Glut1(20μM,Invitrogen)轉(zhuǎn)染至THP-1細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染試劑為(HiperFect Transfection Reagent,Qiagen),48h后脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS;1ug/ml;Sigma)刺激24h,收集細(xì)胞和上清。細(xì)胞和上清分別用于檢測(cè)Glut1的敲除效率和單核細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子的變化。THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA處理48h后轉(zhuǎn)化為T(mén)HP-1-MA,ISG15的敲除采用siRNA-ISG15(20μM,Invitrogen),孵育24h后轉(zhuǎn)染mimics/control,轉(zhuǎn)染試劑為(Hiper Fect Transfection Reagent,Qiagen),48h后LPS刺激24h,收集細(xì)胞和上清。細(xì)胞和上清分別用于檢測(cè)Glut1的敲除效率和單核細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子的變化。siRNA陰性對(duì)照為非特異性Stealth RNAi?Negative Control Duplexes。5.轉(zhuǎn)染miRNA mimics,inhibitors將miRNA的mimics和inhibitors(20μM)和陰性對(duì)照(control)(GenePharma)用HiperFect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen)轉(zhuǎn)染至THP-1,孵育48h后,LPS刺激24h(1ug/ml;Sigma)。收集細(xì)胞用于miRNA和mRNA提取,上清用于IP-10濃度的檢測(cè)。6.逆轉(zhuǎn)錄和熒光實(shí)時(shí)定量PCR提取miRNA用miRNeasy Micro kit(Qiagen)�？俁NA提取采用RNeasy Micro kit(Qiagen),為防止基因組DNA污染,RNA提取后采用DNase I進(jìn)行純化。逆轉(zhuǎn)錄試劑Primpscript?RT reagent kit(TAKARA)將RNA逆轉(zhuǎn)錄。檢測(cè)mi RNA和mRNA相對(duì)表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBR?premix ExTaq?II試劑(TAKARA)。所有的引物序列見(jiàn)表3。miRNA相對(duì)表達(dá)量?jī)?nèi)參基因?yàn)閟mall nucleolar RNA(snRU6),mRNA內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。mi RNA和mRNA相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2~(-ΔΔCt)法。7.檢測(cè)細(xì)胞上清及血漿中細(xì)胞因子稀釋標(biāo)準(zhǔn)品、磁珠、抗體及生物素。在96孔檢測(cè)板中加入50ul磁珠,洗板3次后,加入50ul標(biāo)準(zhǔn)品或血漿,高頻震蕩搖床室溫避光孵育1h,洗板3次后加入25ul抗體,同樣震蕩避光室溫孵育1h,洗板3次后加入50ul SA-PE,避光15min,最后加入125ul Assay buffer,避光孵育后上機(jī)檢測(cè)(Bio-Plex2000,Bio-Rad)。8.IP-10檢測(cè)收集HIV感染者和健康對(duì)照血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清,IP-10檢測(cè)采用ELISA試劑盒(RD Systems)。通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,乘稀釋倍數(shù),計(jì)算IP-10濃度。9.熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)根據(jù)靶基因預(yù)測(cè),IP-10的3'UTR有兩個(gè)miR-21結(jié)合位點(diǎn)(nt 196-202,235-240)。將包含miR-21結(jié)合位點(diǎn)的IP-10 3'UTR片段插入GP-miRGLO載體(GenePharma)。293T細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前一天接種至48孔板,用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000 reagent(Invitrogen)共同轉(zhuǎn)染連接有目的片段的熒光素酶報(bào)告基因載體和miR-21 mimics/inhibitors(20μM)。為了檢測(cè)兩結(jié)合位點(diǎn)是否均發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),分別將IP-10 3'UTR野生型,兩位點(diǎn)的突變序列插入報(bào)告基因載體:突變位點(diǎn)1(mut-1),突變位點(diǎn)2(mut-2)。共同轉(zhuǎn)染miR-21和空載質(zhì)粒(GP-miRGLO),插入野生型的IP-103'UTR和mut-1/mut-2,24h后收集細(xì)胞,用Dual-Luciferase Report Assay(Promega)裂解細(xì)胞并檢測(cè)螢火蟲(chóng)和海腎的熒光強(qiáng)度,進(jìn)行分析。10.統(tǒng)計(jì)分析GraphPad Prism軟件用于統(tǒng)計(jì)分析和制圖,miRNA和mRNA相對(duì)表達(dá)水平及si-Glut1后細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的濃度比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)來(lái)統(tǒng)計(jì)HIV患者和HCs血漿中細(xì)胞因子的差異。用Spearman相關(guān)系數(shù)分析各變量之間的相關(guān)性,P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.HIV感染者抗病毒治療后免疫恢復(fù)效果不同對(duì)入組的HIV感染者樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)IR和INR組在治療12個(gè)月后CD4+T細(xì)胞恢復(fù)情況出現(xiàn)明顯差異,分別為12個(gè)月(P=0.001);18個(gè)月(P=0.003);24個(gè)月(P=0.0003)。將健康對(duì)照的CD4+T細(xì)胞和HIV感染者治療前及檢測(cè)最后一點(diǎn)CD4+T細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)IR組在治療后CD4+T細(xì)胞數(shù)呈明顯的增加(P0.0001),并且CD4+T細(xì)胞數(shù)與健康對(duì)照無(wú)差異。而INR組治療前后則未見(jiàn)明顯差異,治療后CD4+T細(xì)胞數(shù)仍明顯低于健康對(duì)照(P0.0001)。IR組治療后CD4+T細(xì)胞數(shù)明顯高于INR組(P=0.0003)。2.HIV感染者單核細(xì)胞亞群分布及Glut1的表達(dá)情況對(duì)HIV感染者和健康對(duì)照進(jìn)行單核細(xì)胞亞群分析發(fā)現(xiàn),IR組和INR組的[I]群?jiǎn)魏思?xì)胞比例高于健康對(duì)照(P=0.019;P=0.038)。健康對(duì)照組的[NC]群和[I]群的比例無(wú)差異,但在IR組和INR組的[I]群比例均明顯高于NC群(P=0.008;P=0.020),IR和INR兩組之間各亞群均無(wú)差異。對(duì)單核細(xì)胞各亞群以及Glut1的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)Glut1在[NC]群和[I]群?jiǎn)魏思?xì)胞表面表達(dá)明顯升高,在INR組的[NC]群和[I]群?jiǎn)魏思?xì)胞均高于IR組(P=0.016;P=0.008)和健康對(duì)照組(P=0.04;P=0.04)。結(jié)果表明,單核細(xì)胞的各亞群比例與免疫恢復(fù)狀態(tài)無(wú)關(guān),但Glut1的表面表達(dá)在INR組明顯升高,可能為影響免疫恢復(fù)的關(guān)鍵分子。3.Glut1對(duì)單核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的影響為探索Glut1對(duì)單核細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響,用siRNA敲減Glut1,檢測(cè)低表達(dá)Glut1對(duì)活化后單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。發(fā)現(xiàn)僅有IL-6和IP-10在siRNA-Glut1組明顯分泌減少(P=0.004,P=0.042),證明Glut1表達(dá)降低會(huì)減少I(mǎi)L-6和IP-10的分泌水平,可能會(huì)影響免疫應(yīng)答。4.血漿中單核巨噬細(xì)胞相關(guān)的炎性因子與免疫重建的關(guān)系收集19例HIV感染者血漿樣本,其中7例HC和抗病毒治療后HIV感染者血漿樣本12例,包括6例IR,6例INR。結(jié)果表明IP-10在INR組明顯高于IR組和HC組(P=0.048;P=0.001),IP-10為HIV感染抗病毒治療后影響免疫應(yīng)答效果的關(guān)鍵因子,分泌增加可能會(huì)導(dǎo)致單核細(xì)胞的免疫應(yīng)答失敗。5.IP-10在HIV感染者血漿中明顯升高與疾病進(jìn)展有關(guān)通過(guò)檢測(cè)IP-10在HIV感染者和HCs血漿中的分泌水平,發(fā)現(xiàn)HIV感染者血漿IP-10濃度明顯高于HCs(P0.0001),IP-10與CD4+T細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.595,P=0.0003),與病毒載量呈正相關(guān)(r=0.706,P0.0001)。根據(jù)CD4+T細(xì)胞數(shù)量和病毒載量將HIV感染者分為兩組:低CD4+T細(xì)胞數(shù)組(350 cells/μL;P=0.029)和高病毒載量組(LogVL4;P=0.002)血漿中IP-10均顯著升高。說(shuō)明IP-10與HIV疾病進(jìn)展密切相關(guān),IP-10為預(yù)測(cè)疾病的進(jìn)展的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。6.篩選可調(diào)控IP-10的miRNA通過(guò)三個(gè)miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)工具:TargetScan,miRanda和DIANA進(jìn)行預(yù)測(cè)。根據(jù)軟件評(píng)分及匹配程度,在預(yù)測(cè)結(jié)果中挑選出六個(gè)的miRNAs與IP-10 3'UTR有6-7個(gè)保守種子序列匹配,包括:mi R-15a,miR-16,miR-21,mi R-135a,miR-200和miR-503。miR-21與IP-10 3'UTR有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn),其他的miRNAs有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在THP-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)6種miRNA的mimics,LPS刺激后檢測(cè)細(xì)胞上清中IP-10濃度確定可調(diào)節(jié)IP-10水平的miRNAs。結(jié)果表明:過(guò)表達(dá)miR-21(P=0.003)和miR-200c(P0.0001)能夠有效抑制IP-10的分泌,但miR-200c的過(guò)表達(dá)倍數(shù)過(guò)高,無(wú)法在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)(未列出數(shù)據(jù)),最終選擇miR-21進(jìn)行進(jìn)一步研究。7.miR-21可調(diào)節(jié)THP-1細(xì)胞分泌IP-10在THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics過(guò)表達(dá)miR-21,發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)miR-21表達(dá)對(duì)IP-10的mRNA水平?jīng)]有影響,但明顯抑制LPS刺激后的THP-1細(xì)胞分泌IP-10(P=0.041)。表明miR-21可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)IP-10分泌。以同樣的方法轉(zhuǎn)染mi R-21的inhibitors,結(jié)果顯示:miR-21inhibitor并沒(méi)有顯著增加IP-10 mRNA的表達(dá),卻有效的促進(jìn)IP-10的分泌(P=0.015)。說(shuō)明miR-21對(duì)IP-10的調(diào)節(jié)作用是在轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)的。8.miR-21直接靶向調(diào)節(jié)IP-10為探索miR-21與IP-10 3'UTR是否為直接靶向調(diào)控關(guān)系,進(jìn)行熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。首先將帶有WT序列的報(bào)告基因載體與miR-21 mimics或inhibitors共同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)miR-21可直接與IP-10 3'UTR靶向結(jié)合,抑制IP-10的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)路徑。另外通過(guò)共轉(zhuǎn)染miR-21和連接mut-1/mut-2報(bào)告載體與WT載體進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)mi R-21對(duì)IP-10的調(diào)控作用主要是通過(guò)結(jié)合IP-10 3'UTR上結(jié)合位點(diǎn)1(196-202)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。9.miR-21在HIV感染者的單核細(xì)胞下調(diào)為探索原代單核細(xì)胞中miR-21對(duì)IP-10的調(diào)控作用。分別提取HIV感染者(n=6)和HCs(n=5)的PBMC并分選出單核細(xì)胞檢測(cè)miR-21的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)感染者單核細(xì)胞中miR-21的表達(dá)低于HCs(P=0.044),而血漿IP-10水平明顯升高(P=0.029),miR-21表達(dá)與IP-10濃度呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)(r=-0.502,P=0.057)。我們?cè)贖IV感染者的單核細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-21(P=0.002)LPS刺激后可抑制IP-10的分泌(P=0.057)。以上結(jié)果表明,mi R-21可調(diào)控單核細(xì)胞合成分泌IP-10。10.miR-21和IP-10在THP1-MA細(xì)胞表達(dá)升高首先檢測(cè)THP-1到THP-1-MA細(xì)胞分化過(guò)程中miR-21和IP-10表達(dá)水平的變化。發(fā)現(xiàn)miR-21和IP-10在THP-1-MA細(xì)胞中表達(dá)均明顯增加(P=0.002,P=0.037)。隨后檢測(cè)THP-1和THP-1-MA細(xì)胞在LPS刺激前后IP-10的分泌水平。結(jié)果顯示THP-1-MA細(xì)胞分泌的IP-10明顯高于的THP-1細(xì)胞(P=0.0008)。11.THP-1-MA細(xì)胞中mi R-21對(duì)IP-10無(wú)調(diào)節(jié)作用我們已經(jīng)證實(shí)miR-21對(duì)IP-10的調(diào)控作用,但THP-1-MA細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和抑制miR-21但未能有效抑制和促進(jìn)IP-10的分泌。需要進(jìn)一步確定miR-21在巨噬細(xì)胞中對(duì)IP-10的調(diào)控機(jī)制。12.在THP-1-MA細(xì)胞中ISG15表達(dá)升高削弱了miR-21對(duì)IP-10調(diào)節(jié)作用ISG15可通過(guò)NF-κB路徑引起IP-10的分泌,而NF-κB是IP-10產(chǎn)生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)siRNA抑制ISG15表達(dá),可明顯降低IP-10的mRNA表達(dá)(P=0.039)和分泌(P=0.021),同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-21可恢復(fù)對(duì)IP-10分泌的影響,抑制程度高于僅敲減ISG15(P=0.0009)。在THP-1-MA中ISG15表達(dá)增加可促進(jìn)IP-10的表達(dá)分泌,而這種促進(jìn)作用抵消了mi R-21對(duì)IP-10的負(fù)性調(diào)控作用,揭示了在單核和巨噬細(xì)胞中miR-21對(duì)IP-10的差異性調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)論:1通過(guò)檢測(cè)HIV抗病毒治療后,免疫恢復(fù)效果不同感染者的單核細(xì)胞各亞群分布,對(duì)Glut1在各亞群細(xì)胞的表達(dá)情況進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)INR組CD16+單核細(xì)胞表面Glut1表達(dá)明顯增加,在敲減Glut1后,單核細(xì)胞分泌IP-10明顯減少。2在預(yù)測(cè)到的6個(gè)候選miRNAs中篩選出能夠靶向調(diào)控IP-10的miRNA。發(fā)現(xiàn)在單核細(xì)胞中miR-21能夠直接靶向調(diào)控IP-10的分泌。在原代單核細(xì)胞中,miR-21低表達(dá)與IP-10的分泌水平呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。3通過(guò)檢測(cè)巨噬細(xì)胞中miR-21對(duì)IP-10分泌的影響,發(fā)現(xiàn)miR-21在巨噬細(xì)胞中對(duì)IP-10無(wú)明顯調(diào)控作用,而抑制ISG15的表達(dá)可恢復(fù)miR-21對(duì)IP-10的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。ISG15在巨噬細(xì)胞中對(duì)IP-10的抑制程度明顯高于單核細(xì)胞,這種調(diào)控差異的原因之一是ISG15在巨噬細(xì)胞中表達(dá)升高。
【圖文】：

在第一部分的實(shí)驗(yàn)中，收集 HIV 感染者共 19 例，健康對(duì)照 9 例，實(shí)驗(yàn)對(duì)象的詳細(xì)信息見(jiàn)表 1。入組條件為：①治療時(shí)間：18-24 個(gè)月；②治療前 CD4+T 細(xì)胞數(shù)：200-500cells/μL；③ IR：治療后兩點(diǎn)的 CD4+T 細(xì)胞數(shù)均高于治療前(>30%)；INR：治療后兩點(diǎn)的 CD4+T 細(xì)胞數(shù)均低于治療前(<20%)，呈不斷降低的趨勢(shì)，或經(jīng)治療后 CD4+T 細(xì)胞無(wú)明顯的增加。HC:未感染 HIV 病毒的健康人。對(duì)所選 HIV 感染者樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在治療前基線 CD4+T 細(xì)胞無(wú)差異的前提下，分別統(tǒng)計(jì)治療 6 個(gè)月，12 個(gè)月，18 個(gè)月，24 個(gè)月后 CD4+T 細(xì)胞數(shù)的變化情況，發(fā)現(xiàn) IR 和 INR 組在治療 12 個(gè)月后出現(xiàn)明顯差異，分別為 12 個(gè)月 P = 0.001；18 個(gè)月 P = 0.003；24 個(gè)月 P=0.0003 見(jiàn)圖 1A。之后將健康對(duì)照，HIV 感染者治療前及檢測(cè)最后一點(diǎn) CD4+T細(xì)胞進(jìn)行分析，如圖1B，發(fā)現(xiàn)IR組在治療后CD4+T細(xì)胞數(shù)呈明顯的增加(P<0.0001)，并且治療后的 CD4+T 細(xì)胞數(shù)與健康對(duì)照無(wú)差異。而 INR 組治療前后則未見(jiàn)明顯差異，同時(shí)治療后 CD4+T 細(xì)胞數(shù)仍明顯低于健康對(duì)照 P<0.0001。IR 組 CD4+T 細(xì)胞數(shù)明顯高于 INR 組 P = 0.0003。

圖 3. Glut1 對(duì)單核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的影響A. 轉(zhuǎn)染 si-Glut1 后，檢測(cè) THP-1 表面 Glut1 表達(dá)的畫(huà)門(mén)策略；B. 敲減 Glut1 后，THP-1 表面 Glut1 表達(dá)效率；C. 轉(zhuǎn)染 si-Glut1 后 mRNA 水平的敲減效率；D-J. 敲減 Glut1 后，對(duì) IL-1β，IL-6，IL-8，IL-17，IP-10，IFN-r，，TNF-r 分泌的影響。3.4 血漿中單核巨噬細(xì)胞相關(guān)的炎性因子與免疫重建的關(guān)系單核細(xì)胞是細(xì)胞因子分泌的重要來(lái)源之一，相較于[C]群?jiǎn)魏思?xì)胞，[NC]群和[I]群?jiǎn)魏思?xì)胞可分泌更多的促炎性細(xì)胞因子，而這兩群細(xì)胞在 INR 組比例明顯升高，檢測(cè)患者血漿中的細(xì)胞因子是否也分泌增加，收集 19 例受試者血漿樣本，其中抗病毒治療后 HIV 感染者 12 例血漿樣本，包括 IR(n = 6)，INR(n = 6)，健康對(duì)照(n =
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R512.91;R446.6

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本文編號(hào)：2635223