【摘要】：研究背景抗生素在畜牧業(yè)和醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)中的濫用極大促進(jìn)了細(xì)菌的耐藥。近年來,多重耐藥革蘭氏陰性細(xì)菌(Multidrug-resistant Gram-negative Bacteria MDRGNB)不斷涌現(xiàn),使得粘桿菌素成為抵御其感染的唯一有效藥物。粘桿菌素(多粘菌素E)發(fā)現(xiàn)于19世紀(jì)40年代,可有效治療多種革蘭陰性菌的感染。但由于較大的腎毒性和神經(jīng)系統(tǒng)毒性一度被棄用,因此當(dāng)前粘桿菌素耐藥現(xiàn)象較為罕見。傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為粘桿菌素耐藥僅僅通過細(xì)菌染色體介導(dǎo)而在各菌株垂直傳遞。但是,2015年我國學(xué)者在國際上首次報道了大腸桿菌質(zhì)粒mcr-1基因介導(dǎo)的粘桿菌素耐藥。預(yù)示存在著粘桿菌素耐藥在同一種屬細(xì)菌的不同菌株或者不同種屬細(xì)菌間相互傳播擴(kuò)散的潛在威脅。這將導(dǎo)致出現(xiàn)MDRGNB感染后無有效藥物可用的緊迫局面。及時準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)耐藥菌株并加以控制“隔離”是防止粘桿菌素耐藥擴(kuò)散的關(guān)鍵。另一方面,MDRGNB如鮑曼不動桿菌或銅綠假單胞菌的感染往往危及病人生命,快速準(zhǔn)確分析其粘桿菌素敏感性可有效協(xié)助治療,挽救患者生命。因此,行之有效的粘桿菌素耐藥快速檢測方法是應(yīng)對可能出現(xiàn)的“無藥可救”的MDRGNB感染緊迫局面的重要手段。美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI)和歐盟藥敏試驗委員會(The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing EUCAST)所推薦的粘桿菌素藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)方法為微量肉湯稀釋法(Broth Microdilution Method BMD)。但該方法費時費力,細(xì)菌需經(jīng)過純化培養(yǎng)后再培養(yǎng)16-24小時才能獲取藥敏試驗結(jié)果。紙片擴(kuò)散法和E-test法同樣需要16-24小時,且其檢測原理都基于藥物在瓊脂糖中的擴(kuò)散。由于粘桿菌素分子在瓊脂糖中擴(kuò)散速率低,導(dǎo)致藥敏結(jié)果出現(xiàn)較高的假陰性率。而在所有的全自動藥敏分析儀中,法國梅里埃Vitek 2系統(tǒng)可在較短的時間內(nèi)完成檢測,約4-10小時。但其檢測靈敏度僅42%。因此,當(dāng)前亟需開發(fā)粘桿菌素耐藥菌快速檢測新方法!拉曼光譜技術(shù)是有力、可靠的細(xì)菌檢測及表征技術(shù)。起源于分子基團(tuán)振動的拉曼圖譜被視為生物分子結(jié)構(gòu)及組成的“指紋譜”。同時作為分子振動光譜,拉曼光譜能在分子層面提供細(xì)菌與抗菌藥物相互作用的有效信息。這將有利于拉曼光譜在細(xì)菌藥敏試驗研究中的運用。綜上,本研究提出利用拉曼光譜技術(shù)建立快速篩查耐粘桿菌素大腸桿菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的新方法。目的:(1)分析引起細(xì)菌粘桿菌素暴露組與非暴露組間拉曼光譜差異的原因,為擬建立的粘桿菌素耐藥分析新方法提供理論支撐。(2)探索在檢測試樣表面不同區(qū)域、不同厚度層面采樣的拉曼光譜的差異程度,說明擬建立的耐藥分析方法的檢測重復(fù)性。(3)分別確立大腸桿菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的粘桿菌素藥物暴露組藥物濃度,并使用于耐藥菌篩查。(4)初步建立大腸桿菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌粘桿菌素耐藥菌株快速篩查新方法。方法(1)利用主成分分析方法分析暴露組與非暴露組之間拉曼光譜的差異;獲取0.3McF的CAMHB與0 McF、0.2 McF、0.4 McF、0.8 McF細(xì)菌菌液混合試樣的拉曼光譜,以說明拉曼光譜信號的物質(zhì)來源;測定細(xì)菌培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)、核酸濃度及細(xì)菌數(shù)量以說明引起暴露組與非暴露組光譜差異的物質(zhì)基礎(chǔ);獲取相同數(shù)量的暴露組細(xì)菌與非暴露組細(xì)菌拉曼光譜,以說明流失的蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)對試樣拉曼光譜變化的貢獻(xiàn)。(2)利用共聚焦拉曼光譜技術(shù)可在試樣進(jìn)行縱向高分辨率采樣的技術(shù)優(yōu)勢,獲取試樣10μm、20μm、30μm、40μm厚度處的拉曼光譜;以及距離樣本中心分別為100μm、200μm、300μm、400μm處的拉曼光譜,以核酸拉曼特征峰746 cm~(-1)與淀粉拉曼特征峰481 cm~(-1)處的拉曼強(qiáng)度比值的常用對數(shù)值(log R)為比較參數(shù),對比各光譜間的差異程度,以說明擬建立方法的檢測重復(fù)性。(3)分別測定三種細(xì)菌粘桿菌素最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration MIC)為0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml的菌株的藥物最低暴露濃度;根據(jù)CLSI和EUCAST的關(guān)于三種細(xì)菌的粘桿菌素耐藥cut-off值確立暴露組粘桿菌素用藥濃度。(4)檢測三種細(xì)菌共123株臨床菌株,其中大腸桿菌42株,敏感菌30株,耐藥菌12株;鮑曼不動桿菌41株,敏感菌30株,耐藥菌11株;銅綠假單胞菌40株,敏感菌30株,耐藥菌10株,初步評價擬建立方法的檢測靈敏度和特異度。結(jié)果(1)暴露組和非暴露組拉曼光譜存在明顯差異,經(jīng)過第一主成分(1st Principle Component PC1)的載荷圖結(jié)果分析,暴露組細(xì)菌中蛋白質(zhì)及核酸含量顯著低于非暴露組,但淀粉類物質(zhì)含量高于非暴露組;不同比例的CAMHB與菌液混合后拉曼光譜變化明顯,菌液比例越高則歸屬于蛋白質(zhì)和核酸的拉曼譜帶信號強(qiáng)度越高,而CAMHB比例升高則淀粉類物質(zhì)的拉曼峰強(qiáng)越強(qiáng);暴露組培養(yǎng)液中核酸和蛋白質(zhì)濃度顯著高于非暴露組,細(xì)菌數(shù)量則顯著低于暴露組;相同數(shù)量的暴露組細(xì)菌與非暴露組細(xì)菌拉曼光譜差異明顯,說明流失的生命物質(zhì)對拉曼光譜產(chǎn)生了較大影響,所引起的光譜差異可以被檢測出。(2)檢測試樣不同區(qū)域拉曼光譜所計算得出的log R均值為0.200±0.0419,不同厚度層的拉曼光譜所計算得出的log R均值為0.187±0.037,log R值波動范圍較小,說明在試樣表面隨機(jī)采樣時光譜差異程度較低。(3)每種細(xì)菌中粘桿菌素藥敏程度不同的菌株,其最低粘桿菌素暴露濃度隨其粘桿菌素最低抑菌濃度的增大而升高;粘桿菌素藥敏程度相同的三種細(xì)菌中,鮑曼不動桿菌的最低暴露濃度最高;最終確立了本方法暴露組的粘桿菌素用藥濃度為:大腸桿菌,1μg/ml;銅綠假單胞菌,1μg/ml;鮑曼不動桿菌,3μg/ml。(4)方法學(xué)評價結(jié)果:三種細(xì)菌總體檢測靈敏度為90.9%,特異度為91.1%;其中大腸桿菌檢測靈敏度為91.7%,特異度為93.3%;鮑曼不動桿菌檢測靈敏度為90.9%,特異度為86.7%;銅綠假單胞菌檢測靈敏度為90.0%,特異度為93.3%。結(jié)論(1)本粘桿菌素耐藥性分析方法所制備的檢測試樣是細(xì)菌菌體與CAMHB沉淀物的混合物樣本。試樣拉曼光譜來自兩部分,一部分為細(xì)菌菌體蛋白質(zhì)、核酸等生命物質(zhì),另一部分則來自CAMHB培養(yǎng)基的沉淀物(主要為淀粉);藥物暴露組細(xì)菌由于胞內(nèi)物質(zhì)大量流失和細(xì)菌數(shù)量減少,導(dǎo)致混合物試樣中菌體部分比例降低,因此試樣拉曼光譜中與生命物質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)、核酸等的拉曼峰峰強(qiáng)下降。通過聚類分析可以實現(xiàn)暴露組和非暴露組拉曼光譜的分類。(2)混合物試樣的不同區(qū)域或不同厚度層拉曼光譜的log R值說明該混合物具有很高的均質(zhì)性,因此可以保證拉曼信號采集的穩(wěn)定性,隨機(jī)采樣不會影響檢測結(jié)果,即保證了粘桿菌素耐藥菌株檢測的高檢測重復(fù)性。(3)在粘桿菌素最低抑菌濃度相同的三種細(xì)菌中,大腸桿菌與銅綠假單胞菌的粘桿菌素最低暴露濃度較接近而鮑曼不動桿菌最高,這可能與細(xì)菌表面的攜帶電荷數(shù),細(xì)菌的菌體體積大小、形狀相關(guān),需進(jìn)一步的研究論證。(4)通過123株臨床菌株的檢測驗證,檢測效果最好的是大腸桿菌,較為不佳的是鮑曼不動桿菌。然而90.9%的總體檢測靈敏度和91.1%的檢測特異度再加上1.5小時的高效檢測速度說明了新建立的粘桿菌素耐藥分析方法的優(yōu)越性。有望實現(xiàn)對革蘭陰性細(xì)菌粘桿菌素耐藥菌株的快速、高效篩查,成為防控粘桿菌素耐藥擴(kuò)散的重要方法。
【圖文】：

抗生素在全球范圍內(nèi)畜牧業(yè)和醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)中的濫用使抗生素惡化。據(jù)預(yù)測，到 2050 年全球抗菌素耐藥每年將導(dǎo)致 1000 萬人死亡濟(jì)損失 100 萬億美元（圖 1）[1]。有鑒于此，世界衛(wèi)生組織（World on WHO）早在 2001 年就提出遏制抗生素耐藥的全球策略[2]，并呼吁使用抗生素以預(yù)防抗生素耐藥性蔓延。然而，，近年來同時耐受氨基糖、β-內(nèi)酰胺類以及碳青霉烯類（非典型 β-內(nèi)酰胺類）抗生素的 MDRG再加上新型抗菌藥物的研發(fā)進(jìn)展遲緩，使得古老的抗生素粘桿菌素類DRGN 細(xì)菌感染的唯一有效藥物。菌素發(fā)現(xiàn)于 1947 年，是從土壤細(xì)菌多粘類芽孢桿菌中分離出的一種陽tionic Anti-microbial Peptide CAMP）[3]�？捎行е委煻喾N革蘭陰性桿細(xì)菌，鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌等引起的感染。粘桿菌素首先在推廣使用，隨后于 1959 年美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了粘桿菌素在應(yīng)用[3]。

上世紀(jì) 70 年代，由于具有較嚴(yán)重的腎毒性和神經(jīng)系統(tǒng)毒性作用更低的抗生素如氨基糖甙類、喹諾酮類和 β-內(nèi)酰胺類此僅限于各種皮膚病的外用治療和由銅綠假單胞菌感染引療。這可能是目前粘桿菌素耐藥現(xiàn)象仍然少有報道的主要分子包含攜帶陽離子的環(huán)狀七肽和與之相連接的脂肪酸鏈陰性細(xì)菌感染治療的主要機(jī)制有以下兩方面：一方面，帶性細(xì)菌外膜中攜帶負(fù)電荷的類脂 A 分子具有高度親和力。，環(huán)狀七肽取代類脂 A 分子磷酸基團(tuán)的 Ca2+或 Mg2+，因。隨后其脂肪酸鏈插入細(xì)菌胞漿質(zhì)膜的磷脂分子層之間，內(nèi)生命物質(zhì)不斷流失，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[5]。另一方面，內(nèi)毒素（脂多糖 LPS）的主要毒性因子，血液中的粘桿菌中和釋放入血的內(nèi)毒素，從而起到緩解內(nèi)毒素血癥的作用
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R446.5

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