發(fā)布時(shí)間：2020-04-16 00:32

【摘要】：目的:研究銅綠假單胞菌菌毛蛋白PilA的C端部分堿基是否對(duì)PilA誘導(dǎo)IL-1β產(chǎn)生具有重要影響,為闡明PilA誘導(dǎo)IL-1β產(chǎn)生的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)提供基礎(chǔ),以期最終能為研發(fā)新藥提供準(zhǔn)確的靶點(diǎn)。方法:1、根據(jù)銅綠假單胞菌模式菌株P(guān)AO1的菌毛蛋白基因pilA的序列,通過PCR擴(kuò)增pil A和其C端缺失124bp的片段,再將PCR擴(kuò)增片段連接到質(zhì)粒pET-41a(+)上,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中,利用IPTG誘導(dǎo),使之表達(dá)出全長(zhǎng)PilA蛋白(PilA-FL,含GST標(biāo)簽蛋白)和C端部分缺失(缺失124bp)的PilA蛋白(pilA~(108),含GST標(biāo)簽蛋白)。同時(shí)將空質(zhì)粒PET-41a(+)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中,利用IPTG誘導(dǎo),使之表達(dá)出GST標(biāo)簽蛋白。將這三種蛋白(GST標(biāo)簽蛋白、Pil A-FL、pilA~(108))經(jīng)GST親和層析,得到純度較高的可溶性目的蛋白。2、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將PilA-FL、pilA~(108)和GST標(biāo)簽蛋白轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,同時(shí)設(shè)空白組(細(xì)胞培養(yǎng)基中不含血清及抗生素)、對(duì)照組(在不含血清及抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基中加脂多糖(LPS)和脂質(zhì)體)、蛋白轉(zhuǎn)染組(GST標(biāo)簽蛋白組、PilA-FL蛋白組、pilA~(108)蛋白組,在這些蛋白組中加與對(duì)照組相同的培養(yǎng)液,同時(shí)加0.15μg相應(yīng)的蛋白),在培養(yǎng)期間(6h、12h、24h、48h、72h),用倒置顯微鏡觀察每組細(xì)胞形態(tài)的變化。3、在不同的時(shí)間點(diǎn)(6h、12h、24h、48h、72h),分別取各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞培養(yǎng)液,經(jīng)離心取上清液,用ElISA法檢測(cè)IL-1β產(chǎn)生的含量。結(jié)果:1、成功構(gòu)建了兩種重組質(zhì)粒,將空質(zhì)粒PET-41a(+)和重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)及純化,最后得到純度較高的可溶性目的蛋白:GST標(biāo)簽蛋白、PilA-FL蛋白和PilA~(108)蛋白。2、隨著時(shí)間的變化(6h、12h、24h、48h、72h),空白組巨噬細(xì)胞形態(tài)變化不明顯,但對(duì)照組及蛋白轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均發(fā)生明顯改變。對(duì)照組及蛋白轉(zhuǎn)染組在同一時(shí)間點(diǎn)與空白組比較,在6h時(shí)細(xì)胞就開始有了炎癥變化,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡和中毒顆粒,隨著時(shí)間的增加細(xì)胞的炎癥變化越來越嚴(yán)重,胞質(zhì)內(nèi)空泡和中毒顆粒不斷增加、且在48h最為典型,在72h細(xì)胞已開始退化。3、在6h、12h、24h、48h、72h,對(duì)照組及蛋白轉(zhuǎn)染組中IL-1β含量明顯高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);蛋白轉(zhuǎn)染組中IL-1β含量明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);PilA-FL蛋白組和Pil A~(108)蛋白組中IL-1β含量明顯高于GST標(biāo)簽蛋白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);PilA-FL蛋白組和Pil A~(108)蛋白組相比IL-1β含量沒有明顯差異(P0.05)。結(jié)論:1.在加入LPS刺激巨噬細(xì)胞6h時(shí),細(xì)胞炎癥模型已經(jīng)成功構(gòu)建;2.PilA蛋白C端去除的124bp對(duì)PilA蛋白誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生IL-1β可能沒有重要影響;3.銅綠假單胞菌菌毛蛋白誘導(dǎo)IL-1β產(chǎn)生的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)可能不在PilA蛋白基因C端的124個(gè)堿基之中。
【圖文】：

圖 1 菌毛蛋白 PilA 二級(jí)結(jié)構(gòu)成熟 PilA 蛋白的 N 末端有 35 個(gè)氨基酸序列是高度保守的[9]，此區(qū)被認(rèn)為是PilA 蛋白之間相互作用的區(qū)段，使菌毛蛋白連接形成螺旋四級(jí)結(jié)構(gòu)。相比之下，其余的氨基酸序列不太保守，尤其是 D 區(qū)。PilA 蛋白可通過其 D 區(qū)及附近區(qū)段結(jié) 合 真 核 細(xì) 胞 膜 糖 脂 受 體 asialo-GM1 (neutral glycolipidgangliotetraosyl-Ceramide)[10]，此區(qū)段被稱為 C 端受體結(jié)合域，該域位于菌株 PAK的菌毛蛋白 C 端第 128-144 氨基酸殘基之間，相當(dāng)于 PAO1 菌株的 133-149 個(gè)氨基酸殘基。菌株 PAO1 中 PilA 的 C 端受體結(jié)合域單點(diǎn)突變 K130I 后，菌毛不能結(jié)合不銹鋼，而對(duì)人類的口腔上皮細(xì)胞的結(jié)合則增強(qiáng)。因此，C 端受體結(jié)合域的變化對(duì)菌毛與不同表面的結(jié)合具有重要作用。PilA 蛋白含有 KSTQD 模體[11]，位于靠近 C 端的 D 區(qū)（在菌株 PAO1 中，是 PilA 從 N 端到 C 端的的第 135-147 個(gè)氨基酸殘基），KSTQD 模體也存在于

義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文 潘興國(guó) 結(jié)果.1 目的基因擴(kuò)增片段大小鑒定如下圖所示：目的基因片段在 PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增后，利用瓊脂糖凝膠進(jìn)電泳分析，，PilA-FL PCR 產(chǎn)物應(yīng)為 360bp，PilA108PCR 產(chǎn)物應(yīng)為 236bp，由圖知， PCR 產(chǎn)物實(shí)際電泳出來的條帶與設(shè)計(jì)時(shí)的大小吻合。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R446.5

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本文編號(hào)：2629177