發(fā)布時(shí)間：2020-04-09 16:49

【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的呼吸道傳染病,嚴(yán)重地影響人類健康。2018年結(jié)核病全球報(bào)告顯示,2017年估算的新發(fā)結(jié)核病例為1000萬例,約有160萬人死于結(jié)核病,55萬人發(fā)展為耐多藥結(jié)核(MDR-TB,同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥)。中國是第二大結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家,同時(shí)也是耐藥結(jié)核病例最多的國家之一。世界衛(wèi)生組織提出“2035年終結(jié)結(jié)核病”的目標(biāo),所面臨的最大挑戰(zhàn)來自耐藥結(jié)核的出現(xiàn)和傳播。快速、準(zhǔn)確的耐藥結(jié)核菌鑒定可以為制定有效治療方案提供依據(jù),從而減少耐藥菌的產(chǎn)生。耐藥結(jié)核菌的鑒定主要有藥敏實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)診斷,相比于以培養(yǎng)為主的藥敏實(shí)驗(yàn),分子生物學(xué)診斷以耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)的檢測為基礎(chǔ),具有操作簡便、靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn),越來越多的應(yīng)用于耐藥結(jié)核病的臨床診斷。目前,分子生物學(xué)診斷所面臨的問題有:針對(duì)某些藥物,基因突變與耐藥表型聯(lián)系不確定,耐藥突變涉及多基因、多位點(diǎn),聯(lián)合基因突變與耐藥表型的關(guān)系不明確等。異煙肼(Isoniazid,INH)是重要的一線抗結(jié)核藥物,是WHO推薦的DOTs治療藥物,同時(shí),還可用于結(jié)核潛伏感染的預(yù)防性治療。INH耐藥涉及Mtb的多個(gè)基因,目前已知INH耐藥相關(guān)基因有20個(gè),包括代謝酶活性、細(xì)胞壁合成和外排泵相關(guān)的編碼和調(diào)控基因。由于常規(guī)PCR擴(kuò)增獲得基因信息量有限,以往研究文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在部分基因和高頻突變位點(diǎn),如,katG315和inhA啟動(dòng)子區(qū)-15突變。同時(shí),樣本數(shù)量和代表性的限制,針對(duì)其他出現(xiàn)頻率較低的INH耐藥相關(guān)基因突變信息較少,目前還沒有針對(duì)臨床菌株進(jìn)行系統(tǒng)、完整的對(duì)報(bào)道的所有已知INH耐藥相關(guān)基因突變情況的研究。本課題應(yīng)用高通量基因組測序方法,對(duì)我國臨床分離株中INH耐藥相關(guān)基因突變情況進(jìn)行了全面、系統(tǒng)的分析,同時(shí)結(jié)合菌株的耐藥程度結(jié)果,重點(diǎn)聚焦多基因聯(lián)合突變對(duì)INH耐藥進(jìn)化的影響。在對(duì)近期全國耐藥基線調(diào)查中收集的來自全國31個(gè)省72個(gè)采樣點(diǎn)的菌株樣本庫中隨機(jī)抽取的201株結(jié)核分離株(包括168株MDR-TB、20株INH單耐藥和13株敏感株)進(jìn)行全基因組測序和生物信息學(xué)分析,獲得每個(gè)菌株中20個(gè)基因的INH耐藥相關(guān)基因突變信息。同時(shí),通過INH最小抑菌濃度(MIC)測定,獲得菌株的耐藥程度結(jié)果。分析結(jié)果顯示:1)發(fā)現(xiàn)有96.8%(182/188)INH耐藥臨床分離株檢測到INH耐藥相關(guān)基因發(fā)生突變,有18個(gè)結(jié)構(gòu)基因和2個(gè)啟動(dòng)子區(qū)檢測到發(fā)生突變,未檢測到突變的基因有accD6和fabG1,在這些突變類型中katG、inhA/inhA-P和ahpC/ahpC-oxyR區(qū)域的突變比例最高,分別占 85.7%(162/188)、21.8%(41/188)和18.6%(35/188),其他基因的突變頻率在0.53%-4.26%之間;2)針對(duì)katG基因,除檢測到三種katG315突變(占耐藥株51.6%(97/188))外,還檢測到56種非315位點(diǎn)突變(占耐藥株45.21%(85/188)),其中有23種為首次報(bào)道;3)在我國出現(xiàn)的INH耐藥基因突變分化程度高,共檢測出96種突變組合,包括單基因突變?yōu)?8種,多基因聯(lián)合突變?yōu)?8種,分別占耐藥菌株的51.60%和45.21%;4)聯(lián)合突變主要表現(xiàn)為katG的聯(lián)合突變,包括katG315聯(lián)合突變和katG non315聯(lián)合突變。菌株表現(xiàn)為高耐藥程度的聯(lián)合突變包括katG 315和inhA-P聯(lián)合突變,katG non3tG和ahpC-oxyR聯(lián)合突變。我們的結(jié)論是,在我國臨床分離的INH耐藥菌株中基因聯(lián)合突變比較普遍,其中katG315和inhA-P以及katG non315和ahpC-oxyR基因聯(lián)合突變與高INH耐藥水平有關(guān)。此外,katG315位點(diǎn)在MDR-TB菌株中的突變率為54.76%,提示我們針對(duì)katG315位點(diǎn)的INH耐藥分子診斷試劑檢測并不能滿足臨床需求。本課題通過對(duì)結(jié)核耐藥菌INH耐藥相關(guān)基因的聯(lián)合突變和表型耐藥程度的聯(lián)合分析,為深入了解INH耐藥機(jī)制提供了參考信息,為建立更靈敏的INH檢測提供了數(shù)據(jù)支持。
【圖文】：

與活化的ＩＮＨ形成一個(gè)三元絡(luò)合物，它能作用于某些酶，影響分枝桿菌細(xì)胞壁的合逡逑成，例如，飽和酶、環(huán)丙烷酶或參與脂肪酸延伸的酶抑制ＭＡ和細(xì)胞壁的合成，，導(dǎo)逡逑致結(jié)核菌的耐酸性喪失，從而殺死細(xì)菌＿邋（如圖１－丨）。逡逑ＩＮＨ逡逑Ｓｉｍｐｌｅ邋ｐａ？？ｖｅ邋ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ逡逑．邐ｉ邋—邐．．．逡逑ＩＮＨ邋Ｓｕｓｃｅｐｔｆｂｉｅ邋ＴＢ邋ｂａｃｉｌｌｉ逡逑ＩＮＨ逡逑，Ｋ？ｔＧ邐丨＿逡逑？邋Ａｃｔｒ＼？邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋？逡逑？邐ｔＮＨ＊逡逑Ｈ，０＊０－邐：邐－邐ＮＡＤＨ逡逑ＩＮＡＤＨ＊逡逑？ｍｔｔ＜邋？ｔｏｎｆＭｉｏｎ邋ｏｆ逡逑ｌｗｔ＞邋＊ＯＯｉ逡逑ｉ逡逑ｉｎｈｔＭｔｔ邋ｃａｌｌ邋ｗａｌｌ逡逑ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ逡逑Ｋｉｌｌｓ邋Ｂａｃｉｌｌｉ逡逑圖１－１：異煙肼殺菌作用機(jī)制（參考文獻(xiàn)…】）逡逑１１逡逑

／Ｍ．４編碼區(qū)發(fā)生了邋Ｓｅｒ９４邋Ａｌａ替換，這種突變結(jié)合了邋ＩＮＨ和ＮＡＤＨ復(fù)合物，導(dǎo)致逡逑了邋ＩｎｈＡ蛋白的構(gòu)象變化，且目前有針對(duì)該位點(diǎn)突變的ＩＮＨ耐藥診斷試劑據(jù)不逡逑完全統(tǒng)計(jì)，目前發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)區(qū)ａａ突變有９種（如圖１－４）。研究還發(fā)現(xiàn)，／？／以－戶逡逑（／＇／仇４的啟動(dòng)子區(qū)）突變與ＩＮＨ耐藥有關(guān)，在ＩＮＨ耐藥菌株中檢測到５種突變類逡逑型，其中Ｃ邋（－１５）邋Ｔ、Ｔ邋（－８）邋Ｇ／Ａ和Ａ邋（－１６）邋Ｇ這３個(gè)位點(diǎn)突變使ＩｎｈＡ蛋白過逡逑度表達(dá)，從而導(dǎo)致低水平ＩＮＨ耐藥據(jù)報(bào)道，結(jié)核菌ＩＮＨ耐藥產(chǎn)生不僅依賴于逡逑藥物作用靶點(diǎn)或結(jié)合位點(diǎn)的突變，還有依賴啟動(dòng)子區(qū)點(diǎn)突變導(dǎo)致耐藥，如／ｎ／ｄ－／１突逡逑變導(dǎo)致編碼的酶的過度表達(dá)，從而對(duì)ＩＮＨ產(chǎn)生耐藥【５｜】。逡逑Ｉ邋／Ｉ邋／｜邋－？！邋－邋２邋２邋０邋ａ邋ａ逡逑＜邋邋１邋邋＂邐．邋■邋邋邐邋—．邋ｉ邋，邐邐逡逑（ＴＯ）邐（ｊ＾）逡逑邐邐！邐邋—邋邐邐逡逑；邋］逡逑（￡－９邐？逡逑圖］－４：邋／ｎ／７，４基因ａａ突變及分布圖逡逑１３逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R446.5;R52

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本文編號(hào)：2621012