【摘要】：目的:抗生素抗性細(xì)菌(Antibiotic resistant bacteria,ARB)嚴(yán)重威脅全球公共健康。為有效控制細(xì)菌抗生素抗性的產(chǎn)生及其傳播速度,亟待發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致ARB在環(huán)境中的產(chǎn)生和傳播的可能因素并闡明其機(jī)理。傳統(tǒng)的水消毒工藝并不能殺滅所有細(xì)菌,往往會(huì)有部分抵抗力較強(qiáng)的細(xì)菌殘存,其中,部分細(xì)菌仍然保持未損傷狀態(tài)存在,而部分細(xì)菌則會(huì)形成一種傳統(tǒng)方法無(wú)法檢測(cè)出的特殊生理狀態(tài)細(xì)菌——亞致死損傷細(xì)菌。目前尚未見細(xì)菌的生理狀態(tài),尤其是損傷狀態(tài)與抗生素抗性提高之間存在關(guān)聯(lián)的文獻(xiàn)報(bào)道�；谝陨献龀隽思�(xì)菌的損傷狀態(tài)能夠提高抗生素抗性這一假設(shè)。本課題的目的是研究消毒對(duì)細(xì)菌抗生素抗性的影響,驗(yàn)證細(xì)菌的損傷狀態(tài)與抗生素抗性提高之間是否存在關(guān)聯(lián)性并初步探討其機(jī)制,為消毒促進(jìn)水中抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)轉(zhuǎn)移和傳播的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。方法:1.次氯酸鈉暴露和UV照射對(duì)細(xì)菌抗生素抗性的影響:以銅綠假單胞菌為研究對(duì)象,采用不同劑量次氯酸鈉或UV照射不同時(shí)間后,利用微量肉湯稀釋法測(cè)定暴露后的細(xì)菌對(duì)13種代表性抗生素的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC);同時(shí),采用可見光法檢測(cè)暴露后細(xì)菌的CAT酶、GSH-PX酶和SOD酶等抗氧化酶活性;最后,使用Spearman秩相關(guān)分析損傷細(xì)菌濃度與抗生素MIC值之間的相關(guān)性。2.暴露后細(xì)菌提高抗生素抗性的機(jī)制:提取次氯酸鈉暴露和UV照射后的細(xì)菌RNA并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序,通過(guò)差異表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)與細(xì)菌提高抗生素抗性有關(guān)的關(guān)鍵基因,并通過(guò)SYBR Green熒光定量PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證,最終提出消毒促進(jìn)細(xì)菌提高抗生素抗性的可能機(jī)制。3.生活飲用水損傷細(xì)菌的抗生素抗性調(diào)研:分離生活飲用水中損傷細(xì)菌,通過(guò)16S rRNA測(cè)序或生化鑒定試劑盒進(jìn)行菌株鑒定,并采用微量肉湯稀釋法測(cè)定各分離株的MIC值。結(jié)果:1.4 mg/L次氯酸鈉作用20 min的銅綠假單胞菌致死率為50%(半數(shù)致死劑量LD_(50)),該劑量下?lián)p傷細(xì)菌對(duì)氨芐西林(ampicillin,AMP)、氯霉素(chloramphenicol、CHL)、頭孢他啶(ceftazidime,CAZ)的MIC分別提高2,2,5.6倍,且MIC值與LD_(50)下?lián)p傷細(xì)菌濃度成正相關(guān);CAT酶、GSH-PX酶和SOD酶含量比暴露前提高了3.26,5.18,4.79倍;轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果表明,細(xì)菌RND家族藥物外排泵表達(dá)顯著性上調(diào)的基因種類最多且mex EF-oprN相關(guān)基因上調(diào)最為明顯,qPCR結(jié)果也驗(yàn)證了mex E、oprP基因表達(dá)上調(diào)。同時(shí),2 mg/L、8 mg/L次氯酸鈉作用20 min下的細(xì)菌致死率分別為20%、90%,但對(duì)MIC值均未見明顯提高。2.經(jīng)11mJ/cm~2 UV照射劑量暴露后,銅綠假單胞菌對(duì)四環(huán)素(tetracycline,TET)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)、多粘菌素B(polymyxin b PLB)的MIC值分別提高了8.4,4.4,2倍;但MIC值與損傷細(xì)菌濃度無(wú)明顯相關(guān)性;CAT酶、GSH-PX酶和SOD酶含量比UV暴露前提高了105.42,69.95,3.54倍;轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果表明,細(xì)菌藥物外排泵家族基因表達(dá)顯著上調(diào),qPCR結(jié)果驗(yàn)證了RND家族外排泵mexC表達(dá)上調(diào)。3.從12份自來(lái)水水樣中,共計(jì)分離出150株損傷菌,涉及12個(gè)細(xì)菌種屬,其中假單胞菌屬最多,占38%。與質(zhì)控菌相比,90%以上的損傷菌分離株表現(xiàn)出抗生素抗性增強(qiáng),其中銅綠假單胞菌分離株對(duì)AMP、CHL、CAZ、TET、CIP、PB的MIC值均有所提高,且對(duì)CAZ的的MIC值提高倍數(shù)最大,達(dá)到了128倍。芽孢菌屬出現(xiàn)了五重抗生素抗性。結(jié)論:1.次氯酸鈉半致死劑量暴露下的銅綠假單胞菌可顯著提高其抗生素抗性,且與其中的損傷細(xì)菌濃度顯著相關(guān)。其機(jī)制可能主要與mexEF-oprN外排泵基因的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。2.UV暴露可使銅綠假單胞菌的抗生素抗性提高,但與損傷細(xì)菌濃度無(wú)顯著相關(guān)性。其機(jī)制主要與mexC外排泵家族基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)。3.多數(shù)自來(lái)水中的損傷菌分離株對(duì)抗生素呈現(xiàn)較強(qiáng)抗性,假單胞菌屬最多。上述研究結(jié)果表明,次氯酸鈉消毒和UV消毒造成了細(xì)菌損傷,損傷細(xì)菌抗生素抗性增強(qiáng),能夠威脅飲用水安全。
【圖文】：

圖 2-1 轉(zhuǎn)錄組信息分析流程Figure 2-1 Pipeline of bioinformatics analysis2.2.2.8 關(guān)鍵差異表達(dá)基因的驗(yàn)證采用 SYBR Green 熒光定量 PCR 方法對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中有完整基因注鍵差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。用 EZ-10 Spin Column 總 RNA 提取試劑盒提取RNA，樣品為 4 mg/L 次氯酸鈉暴露 1 min,5 min,20 min 的銅綠假單胞菌，為未暴露處理的細(xì)菌，步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。隨后使用 PrimeScript IIcDNA 合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA。引物序列參照文獻(xiàn)或委托寶生物公設(shè)計(jì)并分析其特異性。引物由寶生物公司合成。部分引物序列參照文獻(xiàn)[42-2 所示。表 2-2 引物序列Table 2-2 The primers for SYBR Green qPCR基因 序列 5'-3' 產(chǎn)物長(zhǎng)度mexE-F ATCCGGCACCGCTGAAGGCTGCG 114mexE-R CGACAACGCCAAGGGCGAGTTCACC

Ct(目的基因) － △Ct(標(biāo)準(zhǔn)值)；目的基因的相對(duì)表達(dá)為 2－ ΔΔCt。2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析菌的損傷率與致死率，MIC 值計(jì)算用 Excel 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，抗氧化酶活性的處否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的比較使用 SPSS 22.0 進(jìn)行多個(gè)獨(dú)立樣本的單因素方差傷細(xì)菌濃度與對(duì)不同抗生素的 MIC 值之間的相關(guān)性使用 SPSS 22.0 進(jìn)an 秩相關(guān)分析。2.3 結(jié)果1 次氯酸鈉作用下的細(xì)菌存活規(guī)律與損傷細(xì)菌形成規(guī)律 2，，4，8 mg/L 的次氯酸鈉作用下的銅綠假單胞菌的存活規(guī)律與損傷細(xì)菌如圖 2-2，2-3 所示。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R446.5

【參考文獻(xiàn)】

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