【摘要】：研究背景及目的異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)是治療惡性血液疾病等的重要手段,甚至被認(rèn)為是治愈某些惡性血液疾病的唯一方法。移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)是allo-HSCT后的主要并發(fā)癥,也是當(dāng)前制約allo-HSCT療效的重要因素之一。多種因素影響了 GVHD的發(fā)生發(fā)展,如:HLA配型、供者來源、干細(xì)胞來源、預(yù)處理方案、供受者年齡、性別等。除此外,近年一些研究表明腸道菌群與急性GVHD(acuteGVHD,aGVHD)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。腸道菌群與機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)密切相關(guān),腸道菌群紊亂會改變上皮和粘膜通透性,打破免疫穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致炎癥性疾病的發(fā)生。在allo-HSCT動物模型顯示:腸道厭氧菌(如梭狀芽孢桿菌等)的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸,可促進(jìn)CD4+T細(xì)胞內(nèi)乙�；M蛋白的表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)Foxp3的組蛋白乙�；�,介導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cell,Treg)的組蛋白修飾作用,誘導(dǎo)免疫耐受,減輕aGVHD。此外,需氧菌(如致病性腸桿菌等)除了產(chǎn)生腸毒素破壞腸粘膜并抑制厭氧菌生長外,還可產(chǎn)生大量脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS),LPS透過損傷的黏膜屏障進(jìn)入血液循環(huán)并到達(dá)全身靶器官,激活T細(xì)胞,導(dǎo)致Th細(xì)胞分化失平衡,促進(jìn)aGVHD發(fā)生。但是在人體內(nèi),腸道菌群影響T細(xì)胞免疫平衡的機(jī)制還不清楚。尤其是aGVHD發(fā)生前,腸道菌群對機(jī)體細(xì)胞免疫,Th細(xì)胞分化平衡等的影響,以及哪些菌群在aGVHD的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用都亟待進(jìn)一步研究�；谝陨峡茖W(xué)問題,本研究目的是:探討allo-HSCT后aGVHD和未發(fā)生aGVHD患者,在移植前和造血植入時腸道菌群、T細(xì)胞亞群的差異性;分析腸道菌群與機(jī)體免疫之間的關(guān)系;揭示腸道菌群在aGVHD的發(fā)生發(fā)展中作用及機(jī)理;為臨床aGVHD預(yù)測及aGVHD防治提供新的思路和依據(jù)。方法(1)臨床樣本收集:2015年1月至2016年12月在我院接受allo-HSCT的受者,分別收集病人預(yù)處理前、造血植入時(造血植入后第3-4天)糞便1g左右及外周血4-5ml。基于移植后100內(nèi)aGVHD發(fā)生情況分為二組:aGVHD組(Ⅱ-Ⅳ aGVHD);non-aGVHD組(0-1 aGVHD)。(2)腸道菌群檢測:利用HiPure Stool DNA Kit試劑盒提取菌群基因組DNA,用熒光定量方法檢測樣品濃度,使用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳鑒定樣品完整性。對提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,構(gòu)建菌群文庫,使用Agilent 2100 Bioanalyzer對菌群文庫質(zhì)控;利用HiSeq 2500測序儀對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的16s rRNA V3-V4可變區(qū)進(jìn)行測序,通過SILVA數(shù)據(jù)庫將所測序列進(jìn)行序列比對,并經(jīng)多樣性指數(shù)、LEfSe(Linear discriminant analysis(LDA)effect size,LEfSe)分析等方法對各組微生物種類進(jìn)行多樣性和分類學(xué)的比較,以期發(fā)現(xiàn)aGVHD患者腸道菌群的差異性改變。(3)T細(xì)胞亞群的檢測:采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血T細(xì)胞亞群(Treg、Th17、Th1)的比例,CD4+T細(xì)胞內(nèi)乙�；M蛋白H3(ace-H3)和ace-H4表達(dá)水平(中位熒光強(qiáng)度(median fluorescence intensity,MFI))。(4)細(xì)胞因子的檢測:采用液相芯片技術(shù)檢測血漿細(xì)胞因子----白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-4、IL-10、IL-17A及干擾素(interferon,IFN)-γ表達(dá)水平。(5)相關(guān)性分析:采用Spearman相關(guān)分析,分析腸道菌群與T細(xì)胞亞群、CD4+T細(xì)胞內(nèi)乙�；M蛋白水平的相關(guān)關(guān)系。(6)對aGVHD的預(yù)測:基于移植后患者腸道菌群特征,通過ROC(receiver operator characteristic,ROC)曲線下面積(AUC)評估菌群對aGVHD的預(yù)測價值。對AUC≥0.65的菌群,通過菌群累計(jì)積分再對aGVHD預(yù)測,并分析菌群積分與aGVHD分級的相關(guān)性。結(jié)果(1)二組病人臨床與移植特征:在81例納入本研究的患者中,移植后32例患者發(fā)生Ⅱ-IV度aGVHD、49例患者發(fā)生I度aGVHD或沒有發(fā)生aGVHD。兩組病人除了 aGVHD組有更多病人接受強(qiáng)化預(yù)處理,臨床特征無明顯差異。(2)二組抗菌藥物應(yīng)用:在造血植入前,aGVHD組較non-aGVHD組有更多病人接受β-內(nèi)酰胺類抗菌藥(預(yù)處理開始至植入前,連用3天或以上)。(3)預(yù)處理前二組菌群:預(yù)處理前二組病人的菌群多樣性無顯著差異。菌群結(jié)構(gòu)方面,在門、綱、目、科、屬水平均沒有顯著差異。(4)造血植入時二組菌群差異:造血植入時aGVHD組菌群多樣性低于non-aGVHD組。在菌群結(jié)構(gòu)方面,從綱水平看,梭菌綱(Clostridia)的豐度在aGVHD 組少于 non-aGVHD 組,而 γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)在 aGVHD組多于 non-aGVHD 組。在科水平,Lachnospiraceae、Ruminococcaceae 等的豐度在 aGVHD 組少于 non-aGVHD 組,而 Enterobacteriaceae 在 aGVHD 組多于non-aGVHD 組。(5)抗菌藥物及預(yù)處理對腸道菌群的影響:β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物和萬古霉素均導(dǎo)致菌群多樣性降低。同時β-內(nèi)酰胺類藥物會導(dǎo)致Lachnospiraceae豐度降低;萬古霉素則導(dǎo)致Enterobacteriaceae豐度升高。其次,強(qiáng)化預(yù)處理較標(biāo)準(zhǔn)預(yù)處理會導(dǎo)致菌群多樣性降低,以及Lachnospiraceae和Ruminococcaceaee豐度降低。沒有發(fā)現(xiàn)其他因素對菌群的顯著影響。(6)aGVHD的危險因素:Cox回歸模型分析顯示,β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物應(yīng)用和移植后低菌群多樣性是aGVHD的獨(dú)立危險因素。而患者年齡、供者類型、萬古霉素(靜脈)等不是aGVHD的獨(dú)立危險因素。(7)植入時二組T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子水平:造血植入時aGVHD組外周血Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例低于non-aGVHD組。而aGVHD組Th17細(xì)胞比例高于non-aGVHD組。Th1細(xì)胞比例沒有顯著差異。血漿中細(xì)胞因子IL-17A水平在aGVHD組高于non-aGVHD組,而IL-4、IL-10、IFN-γ表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。(8)CD4+ T細(xì)胞內(nèi)乙�；M蛋白水平與T細(xì)胞亞群的關(guān)系:aGVHD組CD4+T細(xì)胞內(nèi)ace-H3的MFI水平低于non-aGVHD組。ace-H4的MFI水平二組沒有顯著差異。ace-H3的MFI水平與Treg/Th17細(xì)胞數(shù)比值正相關(guān)。沒有發(fā)現(xiàn)ace-H4與Treg/Th17有相關(guān)性。(9)腸道菌群與免疫的關(guān)系:Lachnospiraceae、Ruminococcaceae 和Enterobacteriaceae的豐度與Treg/Th17細(xì)胞數(shù)比值分別呈正相關(guān)、正相關(guān)和負(fù)相關(guān)。Lachnospiraceae、Ruminococcaceae 的豐度與 CD4+T 細(xì)胞內(nèi) ace-H3 的 MFI水平呈正相關(guān)。(10)腸道菌群對aGVHD的預(yù)測價值:在探索腸道菌群對aGVHD的預(yù)測價值時發(fā)現(xiàn),四種菌科的豐度----Lachnospiraceae、Erysipelotrichaceae、Enterobacteriaceae 和 Peptostreptococcaceae 能預(yù)測 aGVHD 的發(fā)生。這四種菌群累計(jì)積分后預(yù)測Ⅱ-Ⅳ和Ⅲ-ⅣaGVHD的ROC曲線下面積分別為0.73和0.85。而且,四種菌群的積分與aGVHD的分級密切相關(guān)(r = 0.560,P0.001)。結(jié)論(1)在allo-HSCT后造血植入時,腸道菌群多樣性和菌群結(jié)構(gòu)都與aGVHD的發(fā)生密切相關(guān),而特定菌群的變化與抗菌藥物應(yīng)用和預(yù)處理損傷有關(guān)。(2)allo-HSCT后,腸道菌群與外周Treg/Th17細(xì)胞免疫平衡以及CD4+T細(xì)胞內(nèi)的ace-H3水平密切相關(guān),可能影響Treg/Th17的免疫平衡及aGVHD發(fā)生發(fā)展。(3)allo-HSCT后造血植入時腸道菌群組合積分不僅能夠預(yù)測aGVHD的發(fā)生,而且能夠預(yù)測aGVHD嚴(yán)重程度。
【圖文】：

ＨＬＡ）的不同，激活同種異體供者Ｔ細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)，發(fā)生Ｔ細(xì)胞亞逡逑群的免疫失衡和細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而引起對受者組織器官的損傷［２，３］。逡逑從ａＧＶＨＤ的病理生理過程來看，ａＧＶＨＤ主要分為三個階段（圖１）邋［４，５］，逡逑首先，在預(yù)處理過程中，，大劑量或超大劑量化療和放療導(dǎo)致宿主組織損傷，繼逡逑而引起炎癥因子如ＴＮＦｋｘ和ＩＬ－ｌｐ邋（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－ｉｐ，ＩＬ－ｉｐ），趨化因子和細(xì)菌產(chǎn)逡逑物（如：脂多糖等）的釋放以及病原體相關(guān)分子模式（Ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ逡逑ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｐａｔｔｅｒｎｓ，邋ＰＡＭＰｓ）表達(dá)，導(dǎo)致宿主固有免疫細(xì)胞活化，包括抗原呈遞逡逑細(xì)胞（Ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ邋ｃｅｌｌｓ，邋ＡＰＣ）；其次，活化的抗原呈遞細(xì)胞例如樹突細(xì)逡逑胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ邋ｃｅｌｌ，ＤＣ）遷移到淋巴結(jié)，激活同種異體反應(yīng)性供體Ｔ細(xì)胞，供逡逑者的ＣＤ４＋Ｔ細(xì)胞活化并分化成包括Ｔ輔助細(xì)胞１邋（Ｔｈｌ邋），和Ｔ輔助細(xì)胞１７邋（Ｔ逡逑輔助１７，Ｔｈｌ７），供體ＣＤ８＋Ｔ細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性Ｔ細(xì)胞１邋（Ｔｅｌ）和細(xì)胞毒逡逑性Ｔ細(xì)胞１７邋（Ｔｃｌ７）。最后

逑１．２方法逡逑１．２．１實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線（圖１－１）逡逑／邋／逡逑Ｌ邐７邐’逡逑／邐ＤＮＡ提取邐ｍ邐—？？？逡逑Ｉ邐，…邐／逡逑ｉ逡逑｜邐ＤＮＡ檢n,逡逑）Ｙｅｓ逡逑￣接頭連接逡逑＇邋ｒ逡逑文庫構(gòu)建逡逑ｚＺ’＇、．邋Ｎｏ逡逑、丫＜邋ｉ邐逡逑Ｃｌｕｓｔｅｒ制備與測序－＊｜統(tǒng)計(jì)分析￣｜逡逑圖１－１邋｜糞便檢測及測序分析流程圖。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋｜邋Ｐｒｏｔｏｃｏｌ邋ｏｆ邋ＤＮＡ邋Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋１６Ｓ邋ｒＲＮＡ邋Ｇｅｎｅ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋ｆｏｒ邋Ｆｅｃａｌ邋Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ逡逑１．２．２標(biāo)本采集逡逑研宄對象為２０１５年１月－２０１６年１２月在我院接受ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ的受者，入組逡逑年齡１８－６０歲�；颊咴谥委熐绊毻瓿裳Ｒ�(guī)、肝腎功能、心電圖、肺部ＣＴ、肺逡逑功能等檢查，并排除移植禁忌。收集患者移植（預(yù)處理）前、造血植入時（造逡逑血植入后第３－４天）糞便ｌｇ左右�；谝浦埠螅保埃皟�(nèi)ａＧＶＨＤ發(fā)生情況分為二逡逑組：ａＧＶＨＤ邋組（ＩＩ－ＩＶａＧＶＨＤ）；邋ｎｏｎ－ａＧＶＨＤ邋組（０－ＩａＧＶＨＤ）。逡逑１．２．３邋ＨＬＡ配型和供者來源逡逑供受者配型均為高分辨基因配型，包括ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－ＤＱＢ１、－ＤＲＢ１，共逡逑１０個位點(diǎn)。供者來源：ＨＬＡ配型全相合供者為ＨＬＡ相合位點(diǎn)＞８，包括同胞逡逑全相合供者以及無關(guān)供者；ＨＬＡ配型不全相合供者為ＨＬＡ相合位點(diǎn)￡８，為單逡逑倍型供者。逡逑１１逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R457.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Aito Ueno;Abhisek Ghosh;Daniel Hung;Ji Li;Humberto Jijon;;Th17 plasticity and its changes associated with inflammatory bowel disease[J];World Journal of Gastroenterology;2015年43期

本文編號：2615645