【摘要】：目的:彈狀病毒科病毒是一類具有廣泛宿主的負鏈RNA病毒,其中包含數(shù)種對人致病的病毒,對公眾健康帶來嚴(yán)重威脅。建立靈敏、快速、準(zhǔn)確的病毒檢測方法對相關(guān)傳染性疾病的診斷和防控有重要意義。鑒于此,本研究旨在建立針對彈狀病毒科中對人致病的10種病毒的實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測方法,包括狂犬病病毒(rabiesvirus,RABV)、費蘭杜病毒(Flanders virus,FLAV)、Hart Park病毒(Hart Park virus,HAPV)、Ekpoma-2病毒(Ekpoma virus-2,EKV-2)、Le Dantec病毒(Le Dantec virus,LDV)、Bas-congo病毒(Bas-congo virus,BASV)、Isfhan病毒(Isfhan virus,ISFV)、Chandipure 病毒(Chandipure virus,CHPV)、印第安納水皰口炎病毒(vesicular stomatitis Indiana virus,VSIV)和新澤西水皰口炎病毒(vesicular stomatitis New Jersey virus,VSNJV),并進行初步的評價和應(yīng)用。方法:1.下載所研究10種彈狀病毒的基因序列并利用Clustal X 2.1軟件進行比對,尋找RNA聚合酶蛋白基因(RNApolymerasegene,Lgene)保守區(qū)域,利用primerexpress3.0軟件進行每種病毒的特異性引物、探針設(shè)計,以Geneious 11.0軟件評價每種引物探針組合的發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物二聚體等結(jié)構(gòu)。利用primer-Blast對引物探針特異性進行初步評價。2.合成每種病毒包含靶基因的部分L基因于pGEM-t easy載體上,利用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄制備每種病毒的RNA標(biāo)準(zhǔn)品。3.利用One-step PrimeScript RT-PCRKit(Perfect Real-time)試劑盒構(gòu)建每種病毒的單重qRT-PCR反應(yīng)體系,并通過改變退火溫度、引物探針濃度優(yōu)化反應(yīng)條件,以Ct值最小、熒光強度最大時的條件為最佳反應(yīng)條件。針對狂犬病病毒單重qRT-PCR,利用10倍系列稀釋的己知病毒滴度的CVS-11病毒細胞培養(yǎng)上清評價其最小檢測病毒滴度,與兩步法、三步法巢式RT-PCR以及基于文獻的N基因qRT-PCR的最低檢測病毒滴度比較;并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算其線性范圍、擴增效率和相關(guān)系數(shù)。利用10倍系列稀釋的RNA標(biāo)準(zhǔn)品評價每種單重qRT-PCR最低檢測核酸拷貝數(shù)量,并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算其擴增效率和相關(guān)系數(shù)。利用每種病毒的單重qRT-PCR對每種病毒的RNA標(biāo)準(zhǔn)品分別進行檢測,確定各單重qRT-PCR之間是否發(fā)生交叉擴增反應(yīng)。合成狂犬病病毒屬中其他9種病毒的部分L基因,評價狂犬病病毒單重qRT-PCR的特異性。4.利用One-step PrimeScript RT-PCRKit(Perfect Real-time)試劑盒,以單重qRT-PCR體系的最佳反應(yīng)條件,組裝多重qRT-PCR體系。同樣利用10倍系列稀釋RNA標(biāo)準(zhǔn)品評價其最低檢測病毒核酸拷貝數(shù)量,并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算其擴增效率和相關(guān)系數(shù)。通過對RNA標(biāo)準(zhǔn)品的重復(fù)檢測,考察多重qRT-PCR的批內(nèi)和批間重復(fù)性。5.為評價多重qRT-PCR的實用價值,用針對狂犬病病毒或其它彈狀病毒的多重qRT-PCR分別對來自中國狂犬病病毒街毒株各個種群的13份鼠腦分離樣本、43份待測腦組織臨床樣本和50份模擬血清樣本進行檢測,并將其結(jié)果與其它檢測方法的結(jié)果進行比較。結(jié)果:1.通過126條狂犬病病毒基因序列比對,尋找到L基因7750-7895(CVS-11 GenBank No.GQ918139株病毒為參考序列)為保守區(qū)域設(shè)計上下游引物和探針;上下游引物探針與793條狂犬病病毒基因序列匹配,堿基差異個數(shù)均小于3個,保證擴增反應(yīng)的順利進行,無發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物二聚體結(jié)構(gòu),引物探針的primer-blast分析結(jié)果中只包含狂犬病病毒基因序列。分別針對其他彈狀病毒L基因保守區(qū)域設(shè)計出了引物探針,篩選出9組無發(fā)卡結(jié)構(gòu)、無引物二聚體結(jié)構(gòu)的引物探針組合,primer-blast分析結(jié)果中只包含待檢病毒基因序列,與病毒序列完全匹配。2.己按照上述方法,制備每種病毒包含靶基因序列的部分L基因RNA標(biāo)準(zhǔn)品,測定每種標(biāo)準(zhǔn)品核酸拷貝濃度。3.選擇引物濃度400nM、探針濃度350nM為最佳反應(yīng)體系,以52℃C為RABBV、LDV、FLAV、HARV、EKV-2、BASV 6種病毒的單重qRT-PCR的退火溫度,以55℃C為ISFV、VSIV、VSNJV、CHPV 4種病毒單重qRT-PCR的退火溫度�？袢〔《締沃豵RT-PCR反應(yīng)靈敏度評價結(jié)果顯示最低檢測病毒滴度為2.7×10-3 FFU/mL,在2.7X 107FFU/mL～2.7×102 FFU/mL之間呈線性趨勢,可建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,相關(guān)系數(shù)為0.9988,擴增效率為105.7%;靈敏度高于基于N基因的狂犬病病毒qRT-PCR(1 X 102倍),同時高于傳統(tǒng)狂犬病病毒兩步法巢式RT-PCR(1 × 102倍)和三步法巢式RT-PCR(1 X 104倍)。每種彈狀病毒的單重qRT-PCR的最低檢測核酸拷貝數(shù)量均為1 X 102 copies/μL,擴增效率均在90%～110%之間,回歸系數(shù)均在0.99以上。特異性評價結(jié)果顯示,狂犬病病毒qRT-PCR能夠特異檢測狂犬病病毒,對狂犬病病毒屬的其他病毒沒有擴增反應(yīng)。各單重qRT-PCR反應(yīng)之間沒有交叉擴增反應(yīng)。4.根據(jù)單重PCR最佳反應(yīng)條件組裝多重PCR反應(yīng)體系,其中狂犬病病毒和LDV兩種病毒組合為組A,FLAV、HARV、EKV-2、BASV四種病毒組合為組B,ISFV、VSIV、VSNJV、CHPV四種病毒組合為組C。印第安納水皰口炎病毒和Chandipura病毒的多重qRT-PCR方法最低檢測核酸拷貝數(shù)量為1 X 103copies/μL,針對其他病毒的多重qRT-PCR方法最低檢測核酸拷貝數(shù)量為1 ×102copies/μL。批間、批內(nèi)重復(fù)性評價結(jié)果顯示,Ct值變異系數(shù)均在5%以下。5.針對標(biāo)本的臨床檢測結(jié)果顯示,狂犬病病毒單重qRT-PCR對覆蓋我國狂犬病病毒街毒株6個種群的13個代表毒株均能夠檢出,待測臨床樣本檢測結(jié)果與直接免疫熒光法檢測結(jié)果完全符合。其他彈狀病毒的多重qRT-PCR對模擬血清樣本檢測結(jié)果準(zhǔn)確性為100%。結(jié)論:本研究建立了針對彈狀病毒科中10種對人致病的病毒的單重及多重qRT-PCR檢測方法,初步評價的結(jié)果表明,我們所建立的qRT-PCR檢測方法靈敏度高,特異性強,且穩(wěn)定性強,能夠在1×108copies/uL～×102copies/uL范圍內(nèi)對核酸樣本中病毒核酸拷貝數(shù)量進行絕對定量檢測�？袢〔《締沃豵RT-PCR能夠?qū)Σ《镜味仍?.7X 107FFU/mL～2.7X 102 FFU/mL之間病毒樣本的病毒滴度進行定量檢測。狂犬病病毒qRT-PCR檢測與其他病毒的多重qRT-PCR臨床樣本檢測結(jié)果準(zhǔn)確性為100%。綜上所述,本研究建立了一種針對彈狀病毒科中對人致病病毒的靈敏、特異、快速的實時熒光定量RT-PCR檢測方法,該方法的建立和推廣可為相關(guān)傳染性疾病的診斷和防控奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所邐碩士學(xué)位論文逡逑共同構(gòu)成了核糖核蛋白（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＲＮＰ）邋［８］。Ｍ蛋白位于膜下方，其功能包括與病逡逑毒核衣殼、脂質(zhì)膜和Ｇ蛋白的尾區(qū)（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｔａｉｌｓ）相互作用組裝病毒粒子，維持病毒顆逡逑粒的緊密結(jié)構(gòu)，并介導(dǎo)病毒從細胞中出芽釋放Ｇ蛋白為跨模型整合蛋白，形成三聚體逡逑結(jié)構(gòu)，構(gòu)成病毒粒子的外表面，負責(zé)與宿主細胞受體結(jié)合，是宿主體內(nèi)中和抗體的靶標(biāo)［１２］逡逑（圖２所示）。逡逑

逡逑ＤＮＡ結(jié)合熒光染料能夠與擴增產(chǎn)物結(jié)合，從而在擴增過程中產(chǎn)生熒光（圖４）。染料同逡逑時能夠與非特異性產(chǎn)物結(jié)合，因此在ＰＣＲ擴增結(jié)束以后進行熔融曲線分析，以區(qū)分特異性逡逑產(chǎn)物和非特異性產(chǎn)物。逡逑５邋ＳＹＢＲ邋ｇｒｅｅｎ邋Ｉ邐邐逡逑0逡逑０0０0０邐一邐ｉ邐0逡逑ｆ邋邐邋？？？？？－邐邐邐逡逑Ｏ邐？邋｜邋＼邋？邋｜邋＼逡逑圖４．熒光染料法原理示意圖＾逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４．邋Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ邋ｄｙｅ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑探針法只能夠檢測特異性擴增產(chǎn)物，因此在近年來應(yīng)用范圍逐漸擴大，其中ＴａｑＭａｎ探逡逑針是當(dāng)前使用最廣泛的水解熒光探針，同時可以在不同的探針上標(biāo)記不同的熒光分子，建逡逑立多重?zé)晒猓校茫襾韺Σ《具M行分型檢測（圖５）�？梢栽跓晒鈽�(biāo)記探針上標(biāo)記核苷酸類似逡逑物，如邋ＬＮＡ邋（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，，鎖定核酸）、ＰＮＡｓ邋（Ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ）、ＺＮＡ邋（Ｚｉｐ逡逑ｎｕｃｌｅｉｃ邋ａｃｉｄｓ）等，提升探針Ｔｍ邋（Ｍｅｌｔｉｎｇ邋Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）值，因此可以將探針設(shè)計的很短。逡逑實時熒光定量ＰＣＲ在臨床快速診斷、治療效果的監(jiān)測和評估、發(fā)現(xiàn)傳染源、疾病流行暴發(fā)逡逑的處置等臨床和公共衛(wèi)生領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。逡逑１８逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R511;R440

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本文編號：2614120