【摘要】：背景:繼限制性酶切片斷長(zhǎng)度多態(tài)性和短串聯(lián)重復(fù)序列之后,單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single-nucleotide polymorphism,SNP)以遺傳標(biāo)記密度高、穩(wěn)定性高、分型檢測(cè)易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的特點(diǎn)成為第3代多態(tài)性標(biāo)記,在遺傳診斷,遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、連鎖不平衡圖譜和遺傳關(guān)聯(lián)分析等人類基因組學(xué)研究領(lǐng)域顯示了強(qiáng)大的應(yīng)用前景。人體存在營(yíng)養(yǎng)素需要量個(gè)體化遺傳特征,通過(guò)研究導(dǎo)致功能和表型改變的編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)的個(gè)體化SNP信息,可以基于SNP分析對(duì)個(gè)體化營(yíng)養(yǎng)素缺乏風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估和干預(yù),通過(guò)基于正常人群和缺乏人群的流行病學(xué)觀察及人群SNP基因分型檢測(cè),可以建立人群SNP基因型頻率分布特征,獲得與營(yíng)養(yǎng)素缺乏風(fēng)險(xiǎn)高度關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)公共數(shù)據(jù)庫(kù),從而實(shí)現(xiàn)基于個(gè)體差異或人群差異特征的精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)干預(yù)。為此,探索快速、準(zhǔn)確、高通量的SNP基因分型技術(shù)以及基于SNP檢測(cè)對(duì)人體營(yíng)養(yǎng)缺乏風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估的研究必要而迫切。目的:一、研究建立人體微量營(yíng)養(yǎng)素缺乏風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)SNP高通量微流體芯片方法通過(guò)文獻(xiàn)薈萃分析篩選提取營(yíng)養(yǎng)相關(guān)聯(lián)的SNPs,優(yōu)化血液和唾液樣本DNA自動(dòng)化提取程序,建立適宜的引物設(shè)計(jì)方法,采用微流體芯片技術(shù),建立微流體芯片營(yíng)養(yǎng)SNP的檢驗(yàn)方法,實(shí)現(xiàn)對(duì)營(yíng)養(yǎng)不良風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估。二、微流體芯片方法的初步應(yīng)用采用人群對(duì)微流體芯片方法進(jìn)行測(cè)試,初步分析基因型數(shù)據(jù)的地域分布特征,并與生化數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,研究營(yíng)養(yǎng)SNPs的檢驗(yàn)方法在微量營(yíng)養(yǎng)素缺乏風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中應(yīng)用的可行性。方法:采用自動(dòng)化提取工作站建立血液和唾液樣本的DNA提取流程,采用競(jìng)爭(zhēng)性等位基因PCR原理設(shè)計(jì)引物,納入了 52個(gè)與維生素A,D,E,B_(6),B2,葉酸,鈣,鐵,鋅和硒微量營(yíng)養(yǎng)素缺乏易感性關(guān)聯(lián)較大的SNP位點(diǎn),SNP檢索和納入原則是在中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)、相關(guān)期刊論文、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)、重慶維普中文科技期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù),PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)和Web of Science中檢索從建庫(kù)至2017年6月25日發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn),檢索主題詞分別為“single nucleotide polymorphism or SNP”and“vitamin A,D,E,B_(6),B_(12),FA,Ca,Iron,Zn,Se”和“單核苷酸多態(tài)性”和“維生素A,D,E,B_(6),B_(12),葉酸,鈣,鐵,鋅和硒”。同時(shí)手工檢索文獻(xiàn),并輔以文獻(xiàn)追蹤法收集更多相關(guān)文獻(xiàn)。建立創(chuàng)新性SNP微流體芯片檢測(cè)方法,并對(duì)如下指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估:(1)防交叉污染能力的測(cè)試:奇數(shù)反應(yīng)孔中預(yù)點(diǎn)引物混合液,偶數(shù)反應(yīng)孔中不點(diǎn)制無(wú)引物混合液。另外,采用凝膠電泳試驗(yàn)對(duì)芯片對(duì)應(yīng)反應(yīng)孔中的溶液進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)重復(fù)操作六次。(2)引物特異性分型能力和準(zhǔn)確性評(píng)估:先將52個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物混合液分別預(yù)點(diǎn)于不同的反應(yīng)孔中,待引物混合液干燥后再將156個(gè)不同的DNA樣本預(yù)點(diǎn)于不同的反應(yīng)孔中,室溫靜止30 min使得芯片干燥,DNA樣本的濃度為10 ng/μl,隨后將PCR預(yù)混液注入到進(jìn)樣通道中。所有的芯片分型檢測(cè)結(jié)果均與對(duì)應(yīng)的二代測(cè)序(NGS)分型結(jié)果進(jìn)行比較。試驗(yàn)重復(fù)操作六次。(3)適宜DNA反應(yīng)濃度檢測(cè):先將52個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物混合液分別預(yù)點(diǎn)于不同的反應(yīng)孔中,再將52個(gè)不同的DNA樣本中每個(gè)樣本都按照1 ng/pl,5ng/μl,10ng/μl和15ng/μl進(jìn)行四個(gè)濃度梯度稀釋。試驗(yàn)重復(fù)操作六次。(4)重現(xiàn)性檢測(cè):先將52個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物混合液分別預(yù)點(diǎn)于不同的反應(yīng)孔中,重現(xiàn)性試驗(yàn)采用一個(gè)DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)重復(fù)操作六次。(5)臨床血液樣本多種營(yíng)養(yǎng)素缺乏風(fēng)險(xiǎn)篩查評(píng)估應(yīng)用:采用所建立的成熟的芯片分型檢測(cè)方法,隨機(jī)選取六個(gè)臨床樣本進(jìn)行評(píng)估應(yīng)用。先將52個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物混合液分別預(yù)點(diǎn)于不同的反應(yīng)孔中,隨后按照芯片檢測(cè)流程進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。(6)血液中提取的DNA與唾液中提取的DNA在芯片上分型結(jié)果的比較:分別獲得三個(gè)人的血液DNA樣本,來(lái)自于同樣的三個(gè)人的唾液DNA樣本。先將52個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物混合液分別預(yù)點(diǎn)于不同的反應(yīng)孔中,隨后按照芯片檢測(cè)流程進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。(7)運(yùn)用二代測(cè)序方法對(duì)芯片分型結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,設(shè)計(jì)二代測(cè)序所需引物序列,目的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約300～450 bp,包含該SNP位點(diǎn)。目的片段的擴(kuò)增,序列測(cè)定工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。運(yùn)用建立的高通量微流體芯片基因分型檢測(cè)方法,對(duì)1130份血細(xì)胞樣本進(jìn)行了基因分型檢測(cè),對(duì)每份樣本檢測(cè)與人體微量營(yíng)養(yǎng)素維生素A,D,E,B_(6),B_(12),葉酸,鈣,鐵,鋅和硒等微量營(yíng)養(yǎng)素缺乏風(fēng)險(xiǎn)高度關(guān)聯(lián)的143個(gè)SNP遺傳標(biāo)記物。該143個(gè)SNP位點(diǎn)的納入原則同上所述。鐵營(yíng)養(yǎng)素相關(guān)生化指標(biāo)與SNP位點(diǎn)易感性分析中,CRP10 mg/l的人被排除在這項(xiàng)研究之外。體內(nèi)鐵儲(chǔ)量采用如下公式進(jìn)行計(jì)算:體內(nèi)鐵儲(chǔ)量(Body iron,BI,mg/kg)=-[log(sTfR*1000/SF)-2.8229]/0.1207。由于數(shù)據(jù)缺失量小于5%,對(duì)連續(xù)變量中的缺失數(shù)據(jù)采用現(xiàn)有數(shù)據(jù)把原始數(shù)據(jù)中的缺失數(shù)值模擬出來(lái)。采用Q-Q圖和Shapiro檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布,若不符合正態(tài)分布,則采用扭曲線性混合模型(Warped linear mixed model,Warped-LMM)對(duì)生化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行變換。扭曲線性混合模型是在標(biāo)準(zhǔn)混合線性模型的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一種分析方法,允許在進(jìn)行遺傳分析的同時(shí)適應(yīng)表型變換,應(yīng)用在生化指標(biāo)變量中,以改善其與正態(tài)分布的配合度,因?yàn)镾F和sTfR濃度呈正偏態(tài)分布。采用R軟件包進(jìn)行PCA、Kinship和SNP位點(diǎn)之間連鎖不平衡分析,分析候選SNP位點(diǎn)的特征。如有種群結(jié)構(gòu)的存在,采用FaST-LMM模型(Factored spectrally transformed linear mixed models)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,首先采用連續(xù)變量探索基因多態(tài)性位點(diǎn)與各種營(yíng)養(yǎng)素之間的關(guān)聯(lián)性,隨后再采用分類變量對(duì)所有的表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。SF的分組標(biāo)準(zhǔn):參照《WST 465-2015人群鐵缺乏篩查辦法》將鐵缺乏的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為SF25 ng/ml,當(dāng)CRP≤5 mg/1時(shí),當(dāng)SF25 μg/1時(shí)判定為鐵缺乏組,當(dāng)SF≥25 μg/1時(shí)判定為正常人群;當(dāng)CRP5 mg/1時(shí),當(dāng)SF32μg/1時(shí)判定為鐵缺乏組;當(dāng)SF≥25μg/1時(shí)判定為正常人群。sTfR的分組標(biāo)準(zhǔn):sTfR4.4 mg/1時(shí)為鐵缺乏組,sTfR≥4.4mg/1時(shí)判定為正常人群。參照《WS/T600—2018人群葉酸缺乏篩查方法》將葉酸(FA)的缺乏標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為FA4 ng/ml時(shí)為葉酸缺乏組,FA≥4 ng/ml時(shí)判定為正常人群。同型半胱氨酸(HCY)和維生素B_(12)的缺乏標(biāo)準(zhǔn)參照檢測(cè)試劑盒上提供的數(shù)據(jù):HCY≥10μM時(shí)為病例組,HCY10μM時(shí)判定為正常人群。B_(12)的分組標(biāo)準(zhǔn):B_(12)425 pg/ml時(shí)為B_(12)缺乏組,B_(12)425 pg/ml時(shí)判定為正常人群。采用卡方檢驗(yàn)分析不同基因型以及等位基因在民族之間的分布差異,采用方差分析分析不同基因以及等位基因攜帶人群的各種生化指標(biāo)的分布情況。根據(jù)P值0.05的閾值確定是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:一、建立了 SNP高通量微流體芯片方法和人體微量營(yíng)養(yǎng)素缺乏風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)方法,包括3個(gè)主要流程:建立了自動(dòng)化DNA提取流程,通過(guò)對(duì)帶有凝膠的血細(xì)胞、EDTA抗凝全血、離心去血清后的血細(xì)胞、新鮮唾液、唾液保存液保存的唾液樣本和口腔拭子采集的口腔黏膜細(xì)胞等各種樣本的提取效果比較,結(jié)果顯示96份新鮮唾液獲取的DNA濃度為150.02±50.97 ng/μl,OD260/280為1.80±0.15,OD260/280為1.50±0.21。從新鮮唾液中獲取DNA含量理想,DNA降解程度低,提取方法簡(jiǎn)單,應(yīng)作為唾液標(biāo)本采集的首選,是開(kāi)展?fàn)I養(yǎng)基因組學(xué)人群研究的有效方法。分析并應(yīng)用了競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)方法。建立了人體微量營(yíng)養(yǎng)素缺乏風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)SNP微流體芯片檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化流程,對(duì)方法的評(píng)估結(jié)果顯示應(yīng)用物理性阻斷技術(shù)實(shí)現(xiàn)了相鄰反應(yīng)孔間的零交叉污染。本研究將5 ng/μl和15 ng/μl分別作為血液和唾液來(lái)源的樣本的適宜DNA反應(yīng)濃度檢測(cè)下限值。芯片平臺(tái)上相同樣本精密度為0.67%～26.06%,相同位點(diǎn)的重復(fù)結(jié)果上沒(méi)有太大的差異。該研究在重現(xiàn)性方面顯現(xiàn)出良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,無(wú)論在芯片內(nèi)還是在芯片間,重現(xiàn)性均良好。六個(gè)臨床樣本多種營(yíng)養(yǎng)素缺乏風(fēng)險(xiǎn)篩查彩色圖譜直觀顯示出多種營(yíng)養(yǎng)素缺乏風(fēng)險(xiǎn),以及單一營(yíng)養(yǎng)素缺乏風(fēng)險(xiǎn)程度,同時(shí)也表明個(gè)體在營(yíng)養(yǎng)素缺乏風(fēng)險(xiǎn)程度上各有其獨(dú)特性。通過(guò)分析三個(gè)個(gè)體血液和唾液兩種來(lái)源的DNA樣本在微流體芯片上的52個(gè)SNP位點(diǎn)分型結(jié)果,并且與二代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果顯示三個(gè)個(gè)體血液和唾液兩種來(lái)源的DNA樣本在芯片上的52個(gè)位點(diǎn)分型結(jié)果完全一致,與二代測(cè)序的結(jié)果也完全一致。二、對(duì)143個(gè)MDR-SNPs位點(diǎn)地域分布特征及關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行了初步探索主成分分析(PCA分析)結(jié)果顯示了存在群體遺傳結(jié)構(gòu)。對(duì)主成分1和主成分2與種群間關(guān)系的方差分析結(jié)果為P1.36e-14,表明143個(gè)SNP位點(diǎn)存在顯著的民族差異。這與樣本的最初個(gè)體信息吻合,也進(jìn)一步印證了本研究中采用的基因分型技術(shù)的準(zhǔn)確性良好。采用函數(shù)snpgdsPCACorr分析了主成分中前三個(gè)成分與SNP位點(diǎn)之間的關(guān)系,結(jié)果表明:3號(hào)染色體上的基因多態(tài)性位點(diǎn)與其他染色體上的多態(tài)性位點(diǎn)均呈現(xiàn)顯著的差異,主成分分析PC1中顯示位于RAB_(6)B基因上的rs2280673解釋效度在25%以下,位于TF基因上的rs1799852解釋效度為25-500%,位于RBP2基因上的rs2118981位點(diǎn)和SRPRB基因上的rs1830084位點(diǎn)解釋效度在50-75%之間,位于TF基因上的rs1358024,rs1525892,rs 1880669,rs381]647,rs3811658,rs6794945,rs7638018,rs8177248八個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的解釋效度為75%以上。采用卡方檢驗(yàn)分析不同基因型以及等位基因在民族之間的分布差異,采用方差分析分析不同基因以及等位基因攜帶人群的各種生化指標(biāo)的分布情況,獲得了大量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的位點(diǎn)。結(jié)論:本研究建立了人體微量營(yíng)養(yǎng)素缺乏風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)SNP微流體芯片檢測(cè)方法,主要包括構(gòu)建了適合于大規(guī)模流行病學(xué)研究的唾液基因組自動(dòng)化DNA提取方法,建立了競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方法,建立了一種高通量微流體芯片基因分型檢測(cè)方法,并采用1130人的小樣本對(duì)方法進(jìn)行了初步測(cè)試應(yīng)用。
【圖文】：

圖２數(shù)據(jù)分析技術(shù)線路圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｄａｔａ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋ｒｏｕｔｅ邋ｄｉａｇｒａｍ逡逑１８逡逑

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心博士學(xué)位論文邐逡逑相同的洗脫體積下提取新鮮樣本的ＤＮＡ濃度略高于－２０邋°Ｃ保存一個(gè)月樣本獲逡逑的ＤＮＡ濃度，建議實(shí)驗(yàn)室在獲得唾液樣本后盡快提�。模危�。隨后對(duì)實(shí)驗(yàn)室里逡逑２份唾液樣本中的ＤＮＡ進(jìn)行了提取和檢測(cè)，獲得了邋９６份合格的ＤＮＡ，，成功逡逑為邋９４．１２％。逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R151.42;R440


本文編號(hào)：2613048