【摘要】：背景:繼限制性酶切片斷長度多態(tài)性和短串聯(lián)重復(fù)序列之后,單核苷酸多態(tài)性位點(single-nucleotide polymorphism,SNP)以遺傳標(biāo)記密度高、穩(wěn)定性高、分型檢測易于實現(xiàn)自動化的特點成為第3代多態(tài)性標(biāo)記,在遺傳診斷,遺傳風(fēng)險評估、連鎖不平衡圖譜和遺傳關(guān)聯(lián)分析等人類基因組學(xué)研究領(lǐng)域顯示了強大的應(yīng)用前景。人體存在營養(yǎng)素需要量個體化遺傳特征,通過研究導(dǎo)致功能和表型改變的編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)的個體化SNP信息,可以基于SNP分析對個體化營養(yǎng)素缺乏風(fēng)險進行評估和干預(yù),通過基于正常人群和缺乏人群的流行病學(xué)觀察及人群SNP基因分型檢測,可以建立人群SNP基因型頻率分布特征,獲得與營養(yǎng)素缺乏風(fēng)險高度關(guān)聯(lián)的SNP位點公共數(shù)據(jù)庫,從而實現(xiàn)基于個體差異或人群差異特征的精準(zhǔn)營養(yǎng)干預(yù)。為此,探索快速、準(zhǔn)確、高通量的SNP基因分型技術(shù)以及基于SNP檢測對人體營養(yǎng)缺乏風(fēng)險進行評估的研究必要而迫切。目的:一、研究建立人體微量營養(yǎng)素缺乏風(fēng)險關(guān)聯(lián)SNP高通量微流體芯片方法通過文獻薈萃分析篩選提取營養(yǎng)相關(guān)聯(lián)的SNPs,優(yōu)化血液和唾液樣本DNA自動化提取程序,建立適宜的引物設(shè)計方法,采用微流體芯片技術(shù),建立微流體芯片營養(yǎng)SNP的檢驗方法,實現(xiàn)對營養(yǎng)不良風(fēng)險的評估。二、微流體芯片方法的初步應(yīng)用采用人群對微流體芯片方法進行測試,初步分析基因型數(shù)據(jù)的地域分布特征,并與生化數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析,研究營養(yǎng)SNPs的檢驗方法在微量營養(yǎng)素缺乏風(fēng)險評估中應(yīng)用的可行性。方法:采用自動化提取工作站建立血液和唾液樣本的DNA提取流程,采用競爭性等位基因PCR原理設(shè)計引物,納入了 52個與維生素A,D,E,B_(6),B2,葉酸,鈣,鐵,鋅和硒微量營養(yǎng)素缺乏易感性關(guān)聯(lián)較大的SNP位點,SNP檢索和納入原則是在中國生物醫(yī)學(xué)文獻數(shù)據(jù)庫、相關(guān)期刊論文、萬方數(shù)據(jù)庫、重慶維普中文科技期刊全文數(shù)據(jù)庫,PubMed數(shù)據(jù)庫和Web of Science中檢索從建庫至2017年6月25日發(fā)表的相關(guān)文獻,檢索主題詞分別為“single nucleotide polymorphism or SNP”and“vitamin A,D,E,B_(6),B_(12),FA,Ca,Iron,Zn,Se”和“單核苷酸多態(tài)性”和“維生素A,D,E,B_(6),B_(12),葉酸,鈣,鐵,鋅和硒”。同時手工檢索文獻,并輔以文獻追蹤法收集更多相關(guān)文獻。建立創(chuàng)新性SNP微流體芯片檢測方法,并對如下指標(biāo)進行評估:(1)防交叉污染能力的測試:奇數(shù)反應(yīng)孔中預(yù)點引物混合液,偶數(shù)反應(yīng)孔中不點制無引物混合液。另外,采用凝膠電泳試驗對芯片對應(yīng)反應(yīng)孔中的溶液進行檢測。試驗重復(fù)操作六次。(2)引物特異性分型能力和準(zhǔn)確性評估:先將52個SNP位點對應(yīng)的引物混合液分別預(yù)點于不同的反應(yīng)孔中,待引物混合液干燥后再將156個不同的DNA樣本預(yù)點于不同的反應(yīng)孔中,室溫靜止30 min使得芯片干燥,DNA樣本的濃度為10 ng/μl,隨后將PCR預(yù)混液注入到進樣通道中。所有的芯片分型檢測結(jié)果均與對應(yīng)的二代測序(NGS)分型結(jié)果進行比較。試驗重復(fù)操作六次。(3)適宜DNA反應(yīng)濃度檢測:先將52個SNP位點對應(yīng)的引物混合液分別預(yù)點于不同的反應(yīng)孔中,再將52個不同的DNA樣本中每個樣本都按照1 ng/pl,5ng/μl,10ng/μl和15ng/μl進行四個濃度梯度稀釋。試驗重復(fù)操作六次。(4)重現(xiàn)性檢測:先將52個SNP位點對應(yīng)的引物混合液分別預(yù)點于不同的反應(yīng)孔中,重現(xiàn)性試驗采用一個DNA樣本進行檢測。試驗重復(fù)操作六次。(5)臨床血液樣本多種營養(yǎng)素缺乏風(fēng)險篩查評估應(yīng)用:采用所建立的成熟的芯片分型檢測方法,隨機選取六個臨床樣本進行評估應(yīng)用。先將52個SNP位點對應(yīng)的引物混合液分別預(yù)點于不同的反應(yīng)孔中,隨后按照芯片檢測流程進行檢測,并對檢測結(jié)果進行分析。(6)血液中提取的DNA與唾液中提取的DNA在芯片上分型結(jié)果的比較:分別獲得三個人的血液DNA樣本,來自于同樣的三個人的唾液DNA樣本。先將52個SNP位點對應(yīng)的引物混合液分別預(yù)點于不同的反應(yīng)孔中,隨后按照芯片檢測流程進行檢測,并對檢測結(jié)果進行分析。(7)運用二代測序方法對芯片分型結(jié)果進行驗證,設(shè)計二代測序所需引物序列,目的擴增片段長度約300～450 bp,包含該SNP位點。目的片段的擴增,序列測定工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。運用建立的高通量微流體芯片基因分型檢測方法,對1130份血細胞樣本進行了基因分型檢測,對每份樣本檢測與人體微量營養(yǎng)素維生素A,D,E,B_(6),B_(12),葉酸,鈣,鐵,鋅和硒等微量營養(yǎng)素缺乏風(fēng)險高度關(guān)聯(lián)的143個SNP遺傳標(biāo)記物。該143個SNP位點的納入原則同上所述。鐵營養(yǎng)素相關(guān)生化指標(biāo)與SNP位點易感性分析中,CRP10 mg/l的人被排除在這項研究之外。體內(nèi)鐵儲量采用如下公式進行計算:體內(nèi)鐵儲量(Body iron,BI,mg/kg)=-[log(sTfR*1000/SF)-2.8229]/0.1207。由于數(shù)據(jù)缺失量小于5%,對連續(xù)變量中的缺失數(shù)據(jù)采用現(xiàn)有數(shù)據(jù)把原始數(shù)據(jù)中的缺失數(shù)值模擬出來。采用Q-Q圖和Shapiro檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布,若不符合正態(tài)分布,則采用扭曲線性混合模型(Warped linear mixed model,Warped-LMM)對生化指標(biāo)數(shù)據(jù)進行變換。扭曲線性混合模型是在標(biāo)準(zhǔn)混合線性模型的基礎(chǔ)上建立起來的一種分析方法,允許在進行遺傳分析的同時適應(yīng)表型變換,應(yīng)用在生化指標(biāo)變量中,以改善其與正態(tài)分布的配合度,因為SF和sTfR濃度呈正偏態(tài)分布。采用R軟件包進行PCA、Kinship和SNP位點之間連鎖不平衡分析,分析候選SNP位點的特征。如有種群結(jié)構(gòu)的存在,采用FaST-LMM模型(Factored spectrally transformed linear mixed models)進行關(guān)聯(lián)分析,首先采用連續(xù)變量探索基因多態(tài)性位點與各種營養(yǎng)素之間的關(guān)聯(lián)性,隨后再采用分類變量對所有的表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析。SF的分組標(biāo)準(zhǔn):參照《WST 465-2015人群鐵缺乏篩查辦法》將鐵缺乏的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為SF25 ng/ml,當(dāng)CRP≤5 mg/1時,當(dāng)SF25 μg/1時判定為鐵缺乏組,當(dāng)SF≥25 μg/1時判定為正常人群;當(dāng)CRP5 mg/1時,當(dāng)SF32μg/1時判定為鐵缺乏組;當(dāng)SF≥25μg/1時判定為正常人群。sTfR的分組標(biāo)準(zhǔn):sTfR4.4 mg/1時為鐵缺乏組,sTfR≥4.4mg/1時判定為正常人群。參照《WS/T600—2018人群葉酸缺乏篩查方法》將葉酸(FA)的缺乏標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為FA4 ng/ml時為葉酸缺乏組,FA≥4 ng/ml時判定為正常人群。同型半胱氨酸(HCY)和維生素B_(12)的缺乏標(biāo)準(zhǔn)參照檢測試劑盒上提供的數(shù)據(jù):HCY≥10μM時為病例組,HCY10μM時判定為正常人群。B_(12)的分組標(biāo)準(zhǔn):B_(12)425 pg/ml時為B_(12)缺乏組,B_(12)425 pg/ml時判定為正常人群。采用卡方檢驗分析不同基因型以及等位基因在民族之間的分布差異,采用方差分析分析不同基因以及等位基因攜帶人群的各種生化指標(biāo)的分布情況。根據(jù)P值0.05的閾值確定是否有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:一、建立了 SNP高通量微流體芯片方法和人體微量營養(yǎng)素缺乏風(fēng)險檢測方法,包括3個主要流程:建立了自動化DNA提取流程,通過對帶有凝膠的血細胞、EDTA抗凝全血、離心去血清后的血細胞、新鮮唾液、唾液保存液保存的唾液樣本和口腔拭子采集的口腔黏膜細胞等各種樣本的提取效果比較,結(jié)果顯示96份新鮮唾液獲取的DNA濃度為150.02±50.97 ng/μl,OD260/280為1.80±0.15,OD260/280為1.50±0.21。從新鮮唾液中獲取DNA含量理想,DNA降解程度低,提取方法簡單,應(yīng)作為唾液標(biāo)本采集的首選,是開展?fàn)I養(yǎng)基因組學(xué)人群研究的有效方法。分析并應(yīng)用了競爭性等位基因特異PCR擴增設(shè)計方法。建立了人體微量營養(yǎng)素缺乏風(fēng)險關(guān)聯(lián)SNP微流體芯片檢測標(biāo)準(zhǔn)化流程,對方法的評估結(jié)果顯示應(yīng)用物理性阻斷技術(shù)實現(xiàn)了相鄰反應(yīng)孔間的零交叉污染。本研究將5 ng/μl和15 ng/μl分別作為血液和唾液來源的樣本的適宜DNA反應(yīng)濃度檢測下限值。芯片平臺上相同樣本精密度為0.67%～26.06%,相同位點的重復(fù)結(jié)果上沒有太大的差異。該研究在重現(xiàn)性方面顯現(xiàn)出良好的實驗結(jié)果,無論在芯片內(nèi)還是在芯片間,重現(xiàn)性均良好。六個臨床樣本多種營養(yǎng)素缺乏風(fēng)險篩查彩色圖譜直觀顯示出多種營養(yǎng)素缺乏風(fēng)險,以及單一營養(yǎng)素缺乏風(fēng)險程度,同時也表明個體在營養(yǎng)素缺乏風(fēng)險程度上各有其獨特性。通過分析三個個體血液和唾液兩種來源的DNA樣本在微流體芯片上的52個SNP位點分型結(jié)果,并且與二代測序結(jié)果進行比較,結(jié)果顯示三個個體血液和唾液兩種來源的DNA樣本在芯片上的52個位點分型結(jié)果完全一致,與二代測序的結(jié)果也完全一致。二、對143個MDR-SNPs位點地域分布特征及關(guān)聯(lián)分析進行了初步探索主成分分析(PCA分析)結(jié)果顯示了存在群體遺傳結(jié)構(gòu)。對主成分1和主成分2與種群間關(guān)系的方差分析結(jié)果為P1.36e-14,表明143個SNP位點存在顯著的民族差異。這與樣本的最初個體信息吻合,也進一步印證了本研究中采用的基因分型技術(shù)的準(zhǔn)確性良好。采用函數(shù)snpgdsPCACorr分析了主成分中前三個成分與SNP位點之間的關(guān)系,結(jié)果表明:3號染色體上的基因多態(tài)性位點與其他染色體上的多態(tài)性位點均呈現(xiàn)顯著的差異,主成分分析PC1中顯示位于RAB_(6)B基因上的rs2280673解釋效度在25%以下,位于TF基因上的rs1799852解釋效度為25-500%,位于RBP2基因上的rs2118981位點和SRPRB基因上的rs1830084位點解釋效度在50-75%之間,位于TF基因上的rs1358024,rs1525892,rs 1880669,rs381]647,rs3811658,rs6794945,rs7638018,rs8177248八個多態(tài)性位點的解釋效度為75%以上。采用卡方檢驗分析不同基因型以及等位基因在民族之間的分布差異,采用方差分析分析不同基因以及等位基因攜帶人群的各種生化指標(biāo)的分布情況,獲得了大量具有統(tǒng)計學(xué)意義的位點。結(jié)論:本研究建立了人體微量營養(yǎng)素缺乏風(fēng)險關(guān)聯(lián)SNP微流體芯片檢測方法,主要包括構(gòu)建了適合于大規(guī)模流行病學(xué)研究的唾液基因組自動化DNA提取方法,建立了競爭性等位基因特異PCR擴增引物設(shè)計方法,建立了一種高通量微流體芯片基因分型檢測方法,并采用1130人的小樣本對方法進行了初步測試應(yīng)用。
【圖文】：

圖２數(shù)據(jù)分析技術(shù)線路圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｄａｔａ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋ｒｏｕｔｅ邋ｄｉａｇｒａｍ逡逑１８逡逑

中國疾病預(yù)防控制中心博士學(xué)位論文邐逡逑相同的洗脫體積下提取新鮮樣本的ＤＮＡ濃度略高于－２０邋°Ｃ保存一個月樣本獲逡逑的ＤＮＡ濃度，建議實驗室在獲得唾液樣本后盡快提�。模危�。隨后對實驗室里逡逑２份唾液樣本中的ＤＮＡ進行了提取和檢測，獲得了邋９６份合格的ＤＮＡ，，成功逡逑為邋９４．１２％。逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R151.42;R440


本文編號：2613048