【摘要】：近年來(lái),尋找和發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的生物標(biāo)志物(Biomarkers)以及對(duì)已知的生物標(biāo)志物的高靈敏檢測(cè)已經(jīng)成為生物/藥物分析的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。生物標(biāo)志物是生物體在異�；蛘呤鞘艿絺Φ臈l件下產(chǎn)生的一類(lèi)激素、核酸或蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)。當(dāng)器官、組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞在受到疾病或者外部環(huán)境的損傷下,其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,產(chǎn)生具有生化指標(biāo)的物質(zhì),發(fā)現(xiàn)以及高靈敏的檢測(cè)這種具有特異性的生物標(biāo)志物對(duì)于疾病的鑒定、早期治療以及預(yù)防起到重要作用。譜學(xué)分析方法包括質(zhì)譜法、熒光法、拉曼分析法、毛細(xì)管電泳法、電化學(xué)分析法等,它們都廣泛的應(yīng)用于生物標(biāo)志物的檢測(cè)。為了更好的分析測(cè)量生物標(biāo)志物,本文選用了基質(zhì)輔助激光解析/電離質(zhì)譜和DNA信號(hào)放大的熒光法作為檢測(cè)手段�；|(zhì)輔助激光解析/電離質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry,MALDI-MS)是一種新型的軟電離生物質(zhì)譜,具有高通量、高準(zhǔn)確率及高分辨率等特點(diǎn)。DNA“馬達(dá)”(DNA motor)也成功的應(yīng)用于熒光信號(hào)的放大�；诖�,本論文運(yùn)用MALDI-MS和熒光構(gòu)建了不同的檢測(cè)方法,結(jié)合DNA“馬達(dá)”自驅(qū)動(dòng)信號(hào)放大的方法,實(shí)現(xiàn)新型生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)以及對(duì)一系列已知生物分子的檢測(cè)。具體研究?jī)?nèi)容包括以下兩個(gè)方面:(1)構(gòu)建一種單細(xì)胞分析的方法,通過(guò)生物質(zhì)譜的檢測(cè)手段研究病毒入侵細(xì)胞后細(xì)胞可能產(chǎn)生的生物標(biāo)志物,用于呼吸道合胞病毒(RSV)的早期發(fā)現(xiàn)。本設(shè)計(jì)運(yùn)用呼吸道合胞病毒感染HEp-2細(xì)胞,通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞是否被感染;隨后使用簡(jiǎn)單的處理手段對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行處理,用MALDI-MS檢測(cè)細(xì)胞感染前后質(zhì)譜信號(hào)峰發(fā)生的變化,通過(guò)對(duì)產(chǎn)生的信號(hào)峰的變化來(lái)分析研究是否有新的生物標(biāo)志物產(chǎn)生。通過(guò)數(shù)據(jù)分析,在分子量為5000~10000 Da范圍內(nèi),有3組信號(hào)峰在正常組和感染組中表達(dá)均有顯著變化,其中1個(gè)差異組分在RSV感染之后表達(dá)上調(diào)(m/z=6154.25),2個(gè)差異組分在RSV感染后表達(dá)下調(diào)(m/z=7658.47和9259.82)。(2)基于以上方法,由于MALDI-MS在檢測(cè)中不能很好的實(shí)現(xiàn)定量分析,并且MALDI-MS產(chǎn)生的信號(hào)峰所對(duì)應(yīng)的蛋白或者是多肽比較復(fù)雜,不能對(duì)其一一解析,目前還不能用于臨床上對(duì)于疾病的早期檢測(cè)以及預(yù)防,因此我們運(yùn)用DNA“馬達(dá)”以及DNA“傳送器”(DNA translator)構(gòu)建一種新型、通用、具有更高準(zhǔn)確度和靈敏度的多靶物檢測(cè)方法。本設(shè)計(jì)運(yùn)用DNA toehold改變的鏈取代反應(yīng)以及以AuNP為基礎(chǔ)構(gòu)建的DNA“馬達(dá)”的信號(hào)放大作用,建立了具有高靈敏度和多靶物的檢測(cè)方法。當(dāng)檢測(cè)單靶物時(shí),加入miRNA 10b后,DNA“傳送器”會(huì)發(fā)生鏈取代反應(yīng),產(chǎn)生的單鏈DNA(ssDNA)啟動(dòng)DNA“馬達(dá)”運(yùn)行,從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。miRNA 10b的檢測(cè)在0-800 pM呈良好的檢測(cè)線(xiàn)性,最低能檢測(cè)到3.5 pM;miRNA 21的檢測(cè)在0-250 pM呈良好的檢測(cè)線(xiàn)性,最低能檢測(cè)到3.5 pM。多靶物檢測(cè)時(shí),運(yùn)用DNA邏輯門(mén)的原理設(shè)計(jì)出NOT-gate,OR-gate和AND-gate。例如,當(dāng)使用AND-gate時(shí),分別加入miRNA 10b、miRNA 21都不會(huì)產(chǎn)生ssDNA來(lái)觸發(fā)DNA“馬達(dá)”運(yùn)行,只有同時(shí)輸入兩個(gè)靶物時(shí)才能發(fā)生取代反應(yīng)生成ssDNA,產(chǎn)生熒光檢測(cè)信號(hào)。綜上所述,我們開(kāi)發(fā)了兩種不同的分析方法:基于MALDI-MS的單細(xì)胞分析方法和基于DNA“傳送器”的熒光信號(hào)放大方法。前者用于鑒定RVS感染的潛在生物標(biāo)志物,后者用于高靈敏的檢測(cè)與乳腺癌相關(guān)的兩種miRNA靶物。疾病生物標(biāo)志物的鑒定和高靈敏檢測(cè)對(duì)分子診斷和疾病治療具有重要意義。
【圖文】：

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文物，例如利巴韋林（Ribavirin），是一種鳥(niǎo)苷類(lèi)似物，具有抗 RSV 和病毒藥物；單克隆抗體、具有高效價(jià)的多克隆免疫球蛋白制劑，能。Zhan 等[7,20]利用雙信號(hào)放大等離子體酶連免疫反應(yīng)（ELISA）將磁離子相結(jié)合以及 AuNP 的聚集來(lái)檢測(cè) RSV，如圖 1-1 所示。Yang 等精（CD）修飾的氧化石墨烯（GO）負(fù)載姜黃素來(lái)有效抑制 RSV 對(duì)達(dá)到抗病毒活性。盡管臨床對(duì) RSV 的研究很多，但目前還沒(méi)有治療細(xì)支氣管炎的方法。

圖 1-2 納米探針通過(guò) PRET 系統(tǒng)檢測(cè) miRNA21[22]。Figure 1-2 Schematic representation of the designed nanoprobe for detection of miRNA 21 based the PRET system. 生物標(biāo)志物檢測(cè)分析的研究現(xiàn)狀生物標(biāo)志物是機(jī)體在受到疾病或者某些外部刺激時(shí)，，機(jī)體產(chǎn)生的能標(biāo)志疾病產(chǎn)生的一類(lèi)物質(zhì)。早在 1980 年就已經(jīng)引入了“生物標(biāo)志物”這個(gè)術(shù)語(yǔ)[39]。廣義上的“
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：O629.7;R44

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