發(fā)布時間：2020-04-02 11:30

【摘要】：目的:本研究基于輻射致Treg異常激活介導放射性肺纖維化的研究,探討輻射對抗原提呈細胞的影響及其特異性激活Treg的機制,明確輻射致抗原提呈功能紊亂激活Treg介導肺上皮細胞EMT,進而參與放射性肺纖維化。本研究為放射性肺纖維化的預防診斷治療提供新的思路和實驗依據(jù)。方法:采用免疫磁珠分選技術(shù)分選小鼠原代調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(regulatory T cell,Treg)、常規(guī)性 T 淋巴細胞(conventional T cell,Tcon)和樹突狀細胞(dendritic cell,DC),小鼠未成熟的樹突狀細胞來源于體外細胞因子誘導實驗。流式細胞術(shù)檢測分選純度及細胞標記物。細胞及動物照射源為60Coγ射線。體內(nèi)動物實驗采用鉛磚局部屏蔽技術(shù)構(gòu)建小鼠放射性肺纖維化模型檢測Treg及DC的變化,體外實驗為小鼠原代細胞共培養(yǎng)技術(shù),通過TSC1特異性地siRNA及TSC1質(zhì)粒構(gòu)建敲低及過表達細胞模型,驗證TSC1調(diào)控DC及特異性激活Treg的機制。結(jié)果:流式細胞術(shù)結(jié)果顯示免疫磁珠分選小鼠原代細胞純度為90%,分選效果良好,滿足后續(xù)實驗。細胞因子誘導骨髓來源的樹突狀細胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)滿足實驗要求,在照射后CD80、CD86以及MHC-Ⅱ的陽性細胞率為60%,呈現(xiàn)顯著地激活狀態(tài)。4Gy及6Gy劑量照射DC細胞后同Tcon細胞共培養(yǎng)誘導Treg細胞的比例分別為15%和25%,能明顯誘導Treg細胞分化。CFSE標記細胞后共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)照射后的DC能明顯誘導Treg增殖。通過體內(nèi)動物實驗發(fā)現(xiàn),小鼠照射后體內(nèi)的DC細胞呈現(xiàn)顯著激活狀態(tài),Treg數(shù)量在前期輕微下降后呈現(xiàn)顯著升高的趨勢。qRT-PCR、Westernblot、免疫熒光實驗顯示DC細胞照射后TSC1的表達下降,敲低TSC1后能明顯誘導Treg細胞分化,同時過表達和照射實驗顯示TSC1正常表達和高表達不能誘導Treg細胞分化。流式細胞術(shù)檢測照射BMDC后CD80、CD86和MHC-Ⅱ顯著活化,且MHC-Ⅱ在敲低TSC1相比于對照組以及過表達加照射組相比于過表達組呈現(xiàn)顯著激活狀態(tài)。ELISA實驗檢測照射后DC分泌細胞因子含量結(jié)果顯示,IL-1 β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α在照射后其含量相比于對照組均有非常顯著的升高趨勢,其中IL-1 β、IL-6在敲低TSC1后分泌量顯著升高,過表達TSC1后分泌量變化沒有統(tǒng)計學意義,過表達加照射組分泌量相比于對照組、照射組、過表達組的變化差異有統(tǒng)計學意義。流式結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-1 β在不同濃度梯度均未能誘導Treg細胞分化(陽性細胞表達率為4%)。IL-6隨濃度的升高誘導Treg分化增強,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。我們用流式細胞術(shù)檢測了 MLE-12細胞Zo-1和N-cadherin的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)同對照組相比實驗組隨著DC加入數(shù)量的增加,其誘導MLE-12細胞發(fā)生EMT的能力增強,且在DC與Tcon比值在1:1的情況下誘導EMT最為顯著(陽性表達細胞率為3%),Western blot實驗結(jié)果顯示上皮標記物E-cadherin和Zo-1隨共培養(yǎng)比例的增加呈現(xiàn)顯著下調(diào)的趨勢,間質(zhì)標記物N-cadherin和Twist隨共培養(yǎng)比例的增加呈現(xiàn)顯著上升的趨勢。免疫熒光實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)上皮標記物E-cadherin熒光表達明顯減弱,間質(zhì)標記物N-cadherin熒光表達顯著增強。結(jié)論:1、輻射激活DC細胞抗原提呈功能。并通過TSC1特異性的激活Treg。2、TSC1特異性調(diào)控DC中MHC-II和IL-6的表達激活Treg,并進一步促進EMT,參與RPF的發(fā)病過程。
【圖文】：

部位［４］0其中上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ邋ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，邋ＥＭＴ）是放射性逡逑肺纖維化發(fā)生的最重要事件，放射性肺纖維化中成纖維細胞有三個主要途徑來源，逡逑其中ＲＩＰＦ過程中成纖維細胞主要來自于ＥＭＴ過程＃３邋（如圖１邋－１）。逡逑ＬＡＰ邋ＲＧＤ＇逡逑ＡＳｔｊｉｕｉｌｉｎｇ邐ｊｐ邐－ｐ逡逑Ｓｉｅｎｕｔｍｅ邐＇逡逑Ｉｍａｔｊｆｉｉｉ］，，邋ＳＵＳＳＩＳ，逡逑ＳＵ１１６Ｓ７逡逑Ｉ逡逑＇邋Ｇ＾ｉｓｅｒｔｂ邋ｓｍａ＾Ｗ邐ＥＭＴ／ＥｎｄＷＩＴ逡逑．邐邐＾＾Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：逡逑Ｉ邐Ｓｍａｄ３邋？逡逑＼邐ｉＭＩＤＣｊＵＸＴＩＭＩＭＩＸ邐／逡逑Ｆｉｂｒｏｓｉｓ逡逑Ｎｕｃｌｅｕｓ逡逑Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ逡逑圖１－１肺上皮細胞發(fā)生ＥＭＴ過程經(jīng)典途徑逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋Ｃｌａｓｓｉｃａｌ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｆｏｒ邋ＥＭＴ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｉｎ邋ｌｕｎｇ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ逡逑ｌ逡逑

２．１．５質(zhì)粒逡逑ＴＳＣ１過表達質(zhì)粒由本人親自構(gòu)建，空載質(zhì)粒為ｐＣＭＶ－Ｆｌａｇ，空載質(zhì)粒圖譜逡逑見圖２－１。逡逑（４４５７）邋Ｏｒａｎｒ邐Ｐｓｆｃｌ邋１４５ＳＳ）逡逑ｔ４３５１）邋Ｎａｅｌ邐Ｉ邐ＢｓｒＧＩ邋（３７６５逡逑＾４３４９）邋ＮｇｏＭＩＶ邐Ｓｐｅｌ邋（３３２）逡逑＾邋ｓ，，ａａｉ邋（ｓ？３３逡逑Ｊ邋＾邐ＥＣ０５３ＩＣＩ邋（３９９）逡逑（３５｛Ｈ）邋Ｘｍｒａｌ邐ｊＲ邋／邋：＜ｉ邐％邋．邐＾邐ＳＳＣＩ邋（９０１）逡逑胸：ｙS緬危苠�，邋｝x椋睿洌礤澹ǎ梗櫻�；亓x希渝澹駑澹澹掊危苠�，邋Ｅａ？劐－邋ＮｅP簦戾澹ǎ梗叮常沖義希保常罰福擔卞危危苠危骸浚ǎ�？◇a﹀義希桑桑蒎危苠澹五澹苠澹祝殄澹

本文編號：2611892