【摘要】：血液中各種細胞成分均來自造血干細胞的增殖和分化,也是基因治療最常用的靶細胞。重組腺病毒是開展臨床試驗最多的基因治療載體,但由于造血細胞不表達腺病毒受體(CAR),其對血細胞的感染效率非常低。誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是通過向分化的體細胞轉入特定的外源轉錄因子進行重編程,從而獲得具有自我更新能力和多能性的細胞,在基礎研究、再生醫(yī)學等眾多科學領域中也有著廣闊的發(fā)展前景和重要的意義。外周血細胞是誘導生成iPSCs的常用細胞類型。我們致力于借助基因治療手段,對包括淋巴細胞和iPSCs在內多種細胞開展基因修飾或改造,將大力提升基因治療在臨床血液疾病中的應用。本課題主要研究了提高血細胞轉染效率的重組腺病毒載體及血細胞誘導的重編程多能干細胞的特性。目的:(1)開展纖維頂球改構的人5型腺病毒對淋巴細胞的高效轉染研究。(2)建立血細胞誘導生成多能干細胞(iPSCs)及分化為MSC的體系。方法:(1)首先,pShuttle-CMV中的CMV啟動子被人EF1a啟動子取代,產生穿梭質粒pSh5EF1a。其次,修飾骨架質粒pAdEasy-1中的纖維基因以產生HAdV-5載體的新骨架質粒。隨后,通過用骨架質粒和線性化pSh5EG電穿孔大腸桿菌BJ5183菌株,用同源重組方法產生腺病毒質粒。用PacI消化上述獲得腺病毒質粒,通過乙醇沉淀回收,并使用Lipofectamine 3000轉染293細胞后三輪冷凍和解凍釋放拯救的病毒,在293細胞中擴增。用傳統(tǒng)的CsCl超速離心法純化擴增的病毒。通過定量純化病毒的基因組DNA來確定顆粒滴度,并通過對293細胞的有限稀釋測定來確定感染滴度。選擇U937,K562,Jurkat和HL-60的四種造血細胞系、人臍血來源CD34~+、人外周血來源T細胞用于評估4種纖維修飾的HAdV-5的基因轉移能力。感染細胞并在2天后分析GFP熒光。(2)對抽取的5-10ml新鮮外周血進行稀釋后梯度離心,獲取外周血單個核細胞(peripheral blood-derived mononuclear cells,MNC)培養(yǎng)。使用編碼OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC的仙臺病毒載體高效轉染少量的淋巴細胞,驅動高度分化的淋巴細胞的命運發(fā)生轉歸,返回到具有多能性的干細胞狀態(tài)。3-4w對出現(xiàn)的iPSCs克隆進行不斷地傳代,剔除包括分化的雜細胞,獲得可以長期穩(wěn)定維持多能干性的iPSCs。并對其細胞形態(tài)、標志性蛋白進行免疫熒光定位鑒定。使用特定培養(yǎng)基誘導已鑒定完全的iPSCs分化為間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC),并對其細胞形態(tài)、標志性蛋白進行流式細胞術鑒定。結果:(1)我們構建了4個第一代腺病毒載體,分別縮寫為F35-EG,F11p-EG,HR-EG和CR-EG。所有載體均可以每個細胞500個病毒顆粒的感染復數(shù)(MOI)轉導超過90%的K562或Jurkat細胞。除HR-EG外的所有載體均可以1000的MOI轉導近90%的臍帶血CD34+細胞或80%的原代人T細胞,并且F11p-EG顯示出對F35-EG和CR-EG的輕微優(yōu)勢。腺病毒載體比CD8+T細胞更有效地轉導CD4+T細胞。這些載體在高達1000vp/細胞的MOI下沒有顯示出細胞毒性,因為感染和未感染的T細胞保持相同的CD4/CD8比率和細胞生長速率。(2)成功分離獲取MNC,并將攜帶四個重編程因子的仙臺病毒載體導入淋巴細胞中,在預期的時間內出現(xiàn)了多個具有iPSCs形態(tài)的克隆。多次傳代培養(yǎng)后,對其標志性蛋白(Nanog、Oct-4、Sox2、SSEA4)進行免疫熒光定位鑒定,結果顯示均為陽性。對iPSCs誘導分化的MSC進行多個表面蛋白的流式細胞術鑒定,結果顯示CD11b、CD19、CD34的表達均低于5%,CD73、CD90、CD105的表達均高于80%。結論:當人EF1a啟動子用于控制轉基因的表達時,HAdV-11p纖維假型HAdV-5可有效轉導人T細胞,表明其可能在T細胞免疫治療中應用。建立了血細胞誘導iPSCs以及iPSCs分化為MSC的實驗體系,為進一步開展基因治療相關研究提供了具有前沿性的模型。
【圖文】：

圖 1（A）攜帶人 EF1a 啟動子的穿梭質粒的構建。（B）構建攜帶修飾纖維基因的骨架質粒。（C）纖維修飾的 HAdV-5 載體。所有載體含有插入 E1 區(qū)的相同的人 EF1a 啟動子控制的 GFP 表達盒和不同修飾的纖維基因CMVp，CMV 啟動子; C-RGD，RGD4C 與 HAdV-11p 纖維的 C 末端融合; EF1ap，人 EF1a 啟動子; ES，封裝信號; HI-RGD，RGD4C 插入 HAdV-11p 纖維旋鈕的 HI 環(huán); ITR，反向末端重復; Knob11p，HAdV-11p 光纖旋鈕; Knob35，HAdV-35 纖維旋鈕; MCS，多克隆站點; pA，SV40 polyA 信號; 軸 11p，HAdV-11p 纖維軸軸 35，HAdV-35 纖維軸; Tail5，HAdV-5 纖維尾部。3.2 轉導造血細胞系選擇 U937，K562，Jurkat 和 HL-60 的四種細胞系用于評估 4 種纖維修飾的HAdV-5 的基因轉移能力。感染細胞并在 2 天后分析 GFP 熒光。 HL-60 是最不敏感的細胞系。當 MOI 增加至 500vp/細胞時，只有 44％的 HL-60 細胞可被 HR-EG感染。對于其他 3 種病毒，，感染效率低于 5％。盡管 HR-EG 是 HL-60 最有效的載體，但它是 U937 中最弱的載體。當以 100vp/細胞的 MOI 感染 HR-EG 時，35％的

25圖 2.通過纖維修飾的 HAdV-5 載體轉導造血細胞系。用 MOI 為 100 或 500vp/細胞的腺病毒載體感染細胞，并在感染后 2 天用流式細胞術分析 GFP 表達。比較不同載體和細胞系中 GFP+細胞的百分比（A）和 GFP+細胞（B）的平均熒光強度。3.3 人 CD34 +臍帶血細胞的轉導從臍帶血單核細胞中分離 CD34+細胞，并用 MOI 為 1000vp/細胞的 4 種載體感染。如圖 3 所示，細胞純度高（CD34+細胞超過 95％），基因轉移效率可接受。HR-EG的效率最低，為55％，F(xiàn)35-EG的基因轉移效率為88％，而F11p-EG和CR-EG的轉錄效率可高達 93％的 CD34+細胞。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R450

【相似文獻】

相關期刊論文 前1條

1 周有祥;;探究與思維 梳理與推敲——2018年北京高考生物學第29題解讀[J];生物學教學;2019年02期

相關碩士學位論文 前1條

1 呂云;造血細胞靶向性腺病毒載體及誘導生成iPSC細胞的研究[D];安徽醫(yī)科大學;2019年

本文編號：2610629