【摘要】：目的:基于同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(ID-LC-MS/MS)建立準(zhǔn)確可靠的血漿/血清醛固酮檢測(cè)方法,優(yōu)化方法學(xué)性能,使其達(dá)到候選參考方法標(biāo)準(zhǔn)。方法:以 ACQUITY UPLCI-CLASS System 色譜儀與 Xevo TQ-S 質(zhì)譜儀(Waters,美國(guó))組建ID-LC-MS/MS系統(tǒng),以醛固酮(Sigma Aldrich)標(biāo)準(zhǔn)溶液作為定量標(biāo)準(zhǔn),以醛固酮同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液為內(nèi)標(biāo),以包括法進(jìn)行定量。對(duì)樣本前處理方法與液質(zhì)系統(tǒng)條件進(jìn)行選擇與優(yōu)化,根據(jù)相關(guān)EP文件要求,對(duì)方法定量限(LOQ)、不精密度、基質(zhì)效應(yīng)、正確度等性能指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。以Westgard網(wǎng)站上導(dǎo)出的血清醛固酮生物學(xué)變異標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)方法性能。結(jié)果:以醛固酮-D8為內(nèi)標(biāo),以陰離子交換固相萃取(Oasis Max96孔板)為樣本前處理方法,以純水與純甲醇為流動(dòng)相,以電噴霧離子源(ESI)負(fù)離子多反應(yīng)檢測(cè)模式(MRM)進(jìn)行檢測(cè),以359.16/189.14為定量離子對(duì),以359.16/331.23為定性離子對(duì)。方法單次分析時(shí)間為6min,生物樣本中干擾可達(dá)到基線分離,無(wú)攜帶污染。方法定量限20pg/mL;低、中、高濃度樣本的重復(fù)性(N=5)與實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度(N=25)分別為2.06%～2.44%與2.54%～3.66%,小于1/2生物學(xué)變異最佳不精密度要求(≤3.675%);低、中、高濃度平均加標(biāo)相對(duì)回收率(N=6)為98.76%～99.11%,回收率偏差小于1/2生物學(xué)變異最佳偏倚要求(≤3.1%)。結(jié)論:本研究建立了一種靈敏特異的醛固酮同位素質(zhì)譜檢測(cè)方法,可作為血漿/清醛固酮檢測(cè)候選參考方法,為醛固酮測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化提供參考。目的:制備醛固酮候選基質(zhì)參考物質(zhì)(SRMs),為各廠家、實(shí)驗(yàn)室提供參考溯源標(biāo)準(zhǔn),改進(jìn)醛固酮檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量,推進(jìn)臨床醛固酮檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。方法:根據(jù)ISO導(dǎo)則35與EP30-A,從北京醫(yī)院內(nèi)分泌實(shí)驗(yàn)室收集剩余新鮮人血清用于制備不同濃度的SRMs。以醛固酮候選參考方法為SRMs進(jìn)行定值。根據(jù)ISO導(dǎo)則35,對(duì)醛固酮SRMs的穩(wěn)定性、均勻性、凍融效應(yīng)與其在不同系統(tǒng)間的互通性進(jìn)行考察。結(jié)果:根據(jù)醛固酮檢測(cè)臨床意義值范圍,制備低、中、高三種濃度水平醛固酮SRMs,其靶值(N=4)分別為 54.61±1.99(pg/g)、139.26±3.47(pg/g)、226.58±7.39(pg/g);三種濃度水平醛固酮SRMs均具有良好均勻性,在-80℃條件下半年穩(wěn)定性良好,無(wú)明顯凍溶效應(yīng);局限于當(dāng)前醛固酮常規(guī)檢測(cè)方法的特異性與溯源性差異以及樣本收集量不足等問(wèn)題,只在國(guó)內(nèi)兩種常見(jiàn)醛固酮常規(guī)方法(索靈、安圖)與一種質(zhì)譜方法(沃特世液質(zhì)系統(tǒng))間進(jìn)行互通性評(píng)價(jià),三種濃度醛固酮SRMs在索靈與沃特世液質(zhì)系統(tǒng)方法間具有互通性。以三種SRMs為樣本開(kāi)展2019年醛固酮能力驗(yàn)證調(diào)查項(xiàng)目,發(fā)現(xiàn)醛固酮測(cè)定方法間存在明顯校準(zhǔn)差異,測(cè)定結(jié)果間可比性不足。以高、低濃度SRMs對(duì)實(shí)驗(yàn)室的中濃度SRMs測(cè)定結(jié)果校準(zhǔn)后,其測(cè)定值可比性明顯改善。結(jié)論:本研究中研制了低、中、高三種濃度水平的醛固酮SRMs,可為各廠家、實(shí)驗(yàn)室間醛固酮檢測(cè)免疫法與質(zhì)譜法提供溯源與量值傳遞標(biāo)準(zhǔn),開(kāi)展正確度驗(yàn)證計(jì)劃,有利于推進(jìn)當(dāng)前醛固酮檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化。目的:比較國(guó)內(nèi)兩種主流化學(xué)發(fā)光免疫分析法(索靈、安圖)及一種同位素稀釋質(zhì)譜法臨床醛固酮測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性與一致性;考察醛固酮候選參考物質(zhì)、廠家質(zhì)控品與室間質(zhì)評(píng)樣本的互通性;結(jié)合醛固酮室間質(zhì)評(píng)數(shù)據(jù),評(píng)價(jià)我國(guó)醛固酮檢測(cè)一致化/標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀。方法:根據(jù)EP9-A3與EP14-A3指南文件,收集濃度初測(cè)值在檢測(cè)方法共同檢測(cè)范圍內(nèi)的45例剩余新鮮單人血漿樣本。根據(jù)EP15-A3指南文件對(duì)待評(píng)價(jià)方法精密度進(jìn)行驗(yàn)證。以Deming回歸分析對(duì)3種醛固酮常規(guī)檢測(cè)方法進(jìn)行兩兩比對(duì),以決定系數(shù)R2評(píng)價(jià)方法間相關(guān)性,以一致性相關(guān)系數(shù)(Concordance Correlation Coefficient,CCC)評(píng)價(jià)方法間一致性,以Bland-Ataman圖分析方法間絕對(duì)與相對(duì)偏差。根據(jù)EP14-A3指南文件對(duì)物質(zhì)互通性進(jìn)行評(píng)價(jià),以95%的可預(yù)測(cè)區(qū)間(Prediction Intervals,PI)為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果:3種醛固酮常規(guī)檢測(cè)方法的精密度均達(dá)到聲稱水平且滿足方法學(xué)比對(duì)要求。索靈與常規(guī)同位素稀釋質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果間具有較好相關(guān)性(R2=0.985)與一致性(CCC=0.967);安圖與索靈/常規(guī)同位素稀釋質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果間相關(guān)性與一致性較差。三種醛固酮常規(guī)檢測(cè)方法間平均相對(duì)偏差均超過(guò)生物學(xué)變異最低偏倚要求(18.6%)。3種常規(guī)醛固酮檢測(cè)方法中,索靈與同位素稀釋質(zhì)譜法的相關(guān)性與特異性滿足互通性評(píng)價(jià)對(duì)方法的要求,低、中、高三種濃度水平的醛固酮候選基質(zhì)參考物質(zhì)在該兩種系統(tǒng)上具有互通性,而索靈、安圖廠家質(zhì)控品在該兩種系統(tǒng)上均不具備互通性,室間質(zhì)量評(píng)價(jià)樣本的互通性難以定論。室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,按試劑分組后,組間均值變異大,且各組內(nèi)醛固酮測(cè)定結(jié)果變異大,提示當(dāng)前醛固酮測(cè)定一致化不理想。結(jié)論:醛固酮常規(guī)檢測(cè)方法測(cè)定醛固酮結(jié)果存在一定差異,方法特異性不足與溯源不統(tǒng)一仍然是當(dāng)前醛固酮檢測(cè)領(lǐng)域亟待解決的難題。醛固酮參考測(cè)量方法、具有互通性的醛固酮基質(zhì)參考物質(zhì)與醛固酮標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃如:室間質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃的開(kāi)展,是推進(jìn)醛固酮檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化、結(jié)果互認(rèn)、原發(fā)性醛固酮增多癥篩查與確診標(biāo)準(zhǔn)一致化的關(guān)鍵之一。
【圖文】：

lp如濃度醛固酮D一內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

昌PE處理后僅達(dá)到基本分離的血漿樣本色譜圖
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R446.1

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本文編號(hào)：2608818