【摘要】：目的研究NEK2在非小細(xì)胞性肺癌中的表達(dá)以及siRNA下調(diào)NEK2表達(dá)后對(duì)非小細(xì)胞性肺癌A549細(xì)胞增殖和放射敏感性的影響及其相關(guān)機(jī)制。方法通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析不同人群中NEK2在非小細(xì)胞性肺癌及其癌旁正常肺組織中的差異表達(dá),Western blot檢測(cè)NEK2在三種非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞A549,H460和H1299及兩種肺正常細(xì)胞HFLIII和HBE中NEK2蛋白表達(dá)情況,并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究下調(diào)NEK2對(duì)非小細(xì)胞性肺癌的放射敏感性的影響及其機(jī)制。本研究通過(guò):(1)Western blot法驗(yàn)證NEK2 siRNA在A549細(xì)胞中的沉默效果;(2)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染NEK2 siRNA后對(duì)A549細(xì)胞增殖和放射敏感性的影響;(3)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)下調(diào)NEK2表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞輻射誘導(dǎo)的凋亡和周期阻滯的影響;(4)細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)NEK2表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞輻射誘導(dǎo)的衰老的影響;(5)細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)下調(diào)NEK2表達(dá)對(duì)輻射誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂形成與修復(fù)的影響以及對(duì)細(xì)胞有絲分裂形態(tài)和核形態(tài)的影響;(6)Western blot法檢測(cè)A549細(xì)胞照射前NEK2敲除后,細(xì)胞凋亡、周期、DNA損傷修復(fù)等相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果NEK2在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織,在三種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)也明顯高于兩種正常肺細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)Western blot結(jié)果顯示siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞24和48h后,兩個(gè)不同的NEK2 siRNA均能明顯抑制NEK2的表達(dá);(2)在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)NEK2表達(dá)后能夠抑制A549細(xì)胞的增殖能力(p0.05);(3)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)NEK2表達(dá)可以提高A549細(xì)胞對(duì)放射的敏感性,其中平均致死劑量(D_0)從2.34Gy下降到2.03Gy(siRNA1)和1.65Gy(siRNA2),放射增敏比(SER)分別為1.16(siRNA1)和1.42(siRNA2);(4)下調(diào)NEK2表達(dá)聯(lián)合4Gy X射線能夠增加A549細(xì)胞的凋亡率,細(xì)胞凋亡率由10.42%增長(zhǎng)至16.68%。Western blot結(jié)果顯示PARP、Caspase3總蛋白表達(dá)下降,活化的PARP、Caspase3表達(dá)增高,凋亡抑制蛋白Bcl2的表達(dá)下降,與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果一致,下調(diào)NEK2表達(dá)可以促進(jìn)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;(5)下調(diào)NEK2表達(dá)可以增加輻射誘導(dǎo)的G2/M期阻滯,增加細(xì)胞對(duì)射線的敏感性,Western blot結(jié)果顯示,下調(diào)NEK2可以減少細(xì)胞周期蛋白p-CDC25C和CDK1的表達(dá),從而抑制了G2/M期的轉(zhuǎn)換;(6)β-半乳糖苷酶染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),下調(diào)NEK2表達(dá)可以明顯增加輻射誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的衰老比例,從11.70%升高至26.65%;(7)細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)下調(diào)NEK2表達(dá)能增加輻射誘導(dǎo)的γ-H2AX焦點(diǎn)的形成并延長(zhǎng)其存在的時(shí)間;Western blot結(jié)果顯示DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵蛋白R(shí)ad51的功能受到抑制從而影響DNA雙鏈斷裂的修復(fù)效率;(8)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)α-tublin和γ-tublin免疫熒光染色觀察細(xì)胞有絲分裂形態(tài)變化以及通過(guò)DAPI染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化,下調(diào)NEK2表達(dá)明顯增加了輻射誘導(dǎo)的染色體分離失誤比例和異常核形態(tài)比例,從17.82%增長(zhǎng)至44.64%。結(jié)論NEK2在非小細(xì)胞性肺癌中高表達(dá);轉(zhuǎn)染NEK2 siRNA后能夠明顯下調(diào)人非小細(xì)胞性肺癌A549細(xì)胞中NEK2的表達(dá)并能抑制細(xì)胞的增殖能力;下調(diào)NEK2表達(dá):能夠明顯提高A549細(xì)胞的放射敏感性;誘導(dǎo)輻射誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的凋亡、衰老和有絲分裂失誤;延長(zhǎng)輻射誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的G2/M期阻滯;增加輻射誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂形成數(shù)量并抑制DNA損傷修復(fù)效率。
【圖文】：

.1 NEK2 mRNA 在非小細(xì)胞性肺癌及其癌旁組織中的表K2 在非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況ern blot 檢測(cè)人肺正常細(xì)胞 HFLIII 和 HBE 以及非 H1299 中的 NEK2 蛋白表達(dá)水平(圖 1.3.2)。實(shí)驗(yàn)49，H460 和 H1299 細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯高于在三種肺癌細(xì)胞系中，NEK2 在 A549 細(xì)胞系中的中的表達(dá)，因此選用 A549 細(xì)胞進(jìn)行接下來(lái)的相圖 1.3.2 NEK2 在非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

2 mRNA 在非小細(xì)胞性肺癌及其癌旁組織中的小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況 檢測(cè)人肺正常細(xì)胞 HFLIII 和 HBE 以及 中的 NEK2 蛋白表達(dá)水平(圖 1.3.2)。實(shí)60 和 H1299 細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯高癌細(xì)胞系中，，NEK2 在 A549 細(xì)胞系中達(dá)，因此選用 A549 細(xì)胞進(jìn)行接下來(lái)的
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R734.2;R730.55

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本文編號(hào)：2607048