【摘要】：鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii,AB)和淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)都屬于奈瑟氏菌科細(xì)菌,均已成為嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問題。鮑曼不動(dòng)桿菌常引起肺炎、菌血癥、腦膜炎、傷口感染等疾病,死亡率高。淋病奈瑟菌感染引起的淋病是全球第二大性傳播疾病,可導(dǎo)致不孕不育等嚴(yán)重后果。兩種病原菌耐藥形勢(shì)日趨嚴(yán)峻,由于耐藥問題導(dǎo)致治療失敗的病例不斷有報(bào)道。細(xì)菌獲得耐藥性可能導(dǎo)致其毒力發(fā)生改變,鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥株往往形成生物膜的能力更強(qiáng),但也有相反結(jié)論的報(bào)道,其他毒力與耐藥性之間的相關(guān)性未見報(bào)道。本研究第一部分旨在研究鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性與毒力之間的相關(guān)性,為有效防治耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌引起的感染提供有效依據(jù)。細(xì)菌中存在大量非編碼RNA(sRNA),sRNA參與調(diào)控細(xì)菌耐藥性的作用已被廣泛證明,但淋病奈瑟菌中尚未有調(diào)控耐藥性sRNA的相關(guān)報(bào)道。本研究第二部分旨在發(fā)現(xiàn)淋病奈瑟菌中調(diào)控頭孢曲松耐藥性的sRNA,為解決其耐藥性問題提供一個(gè)新的思路。一、鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性與毒力相關(guān)性研究為研究鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性與毒力的相關(guān)性,對(duì)課題組收集的36株臨床分離株進(jìn)行16S rRNA基因鑒定,確認(rèn)為鮑曼不動(dòng)桿菌的菌株用紙片擴(kuò)散法和微量液體稀釋法檢測(cè)其對(duì)9類21種抗生素的耐藥性;為檢測(cè)血清抗性,用10%菌液與90%正常人血清(熱滅活人血清作對(duì)照)混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中共孵育1-3 h后檢測(cè)存活細(xì)菌數(shù)(CFU),當(dāng)實(shí)驗(yàn)組CFU小于對(duì)照組CFU且存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí)認(rèn)為該菌株血清抗性弱,無顯著差異的為強(qiáng)血清抗性菌株;粘附試驗(yàn)中以感染復(fù)數(shù)(MOI)為100將菌液與人肺上皮細(xì)胞混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h,用PBS洗去未粘附在細(xì)胞表面的細(xì)菌,裂解細(xì)胞后通過細(xì)菌計(jì)數(shù)檢測(cè)粘附于細(xì)胞的細(xì)菌數(shù),計(jì)算得到粘附于每個(gè)細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)表示該菌株的粘附能力;菌株體內(nèi)毒力檢測(cè)時(shí)用氣管插管法構(gòu)建小鼠肺炎模型,選擇5株耐藥性不同的菌株進(jìn)行感染,統(tǒng)計(jì)小鼠7天內(nèi)死亡率。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性與上述3種毒力的相關(guān)性。結(jié)果顯示,36株細(xì)菌中的34株為鮑曼不動(dòng)桿菌,其中多重耐藥株和廣泛耐藥株比例高達(dá)97.06%;血清抗性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)26株強(qiáng)血清抗性菌,9株弱血清抗性菌,耐藥株具有更強(qiáng)的血清抗性;鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥株粘附A549細(xì)胞的能力相對(duì)非耐藥株更強(qiáng);小鼠感染廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌7天內(nèi)死亡率更高。上述結(jié)果提示鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥形勢(shì)非常嚴(yán)峻,耐藥株具有更強(qiáng)的毒力,耐藥性與毒力之間呈正相關(guān)。二、淋病奈瑟菌頭孢曲松耐藥相關(guān)sRNA篩查為篩選淋病奈瑟菌WHO-A株中調(diào)控頭孢曲松耐藥性的sRNA,首先提取WHO-A株總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,然后通過梯度劑量誘導(dǎo)淋病奈瑟菌頭孢曲松耐藥株,生物信息學(xué)方法篩選并熒光定量PCR驗(yàn)證候選sRNA表達(dá)水平,反轉(zhuǎn)錄PCR驗(yàn)證耐藥相關(guān)sRNA在淋病奈瑟菌臨床分離株中的分布。結(jié)果顯示經(jīng)誘導(dǎo)WHO-A株產(chǎn)生MIC=1 μg/ml的耐藥變異株,野生型WHO-A株存在1051條sRNAs,其中80條與penA、porB、mtrR等8個(gè)耐藥相關(guān)基因間存在互補(bǔ)關(guān)系,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)10條表達(dá)水平隨耐藥性增高而降低的sRNAs,并且其中6條sRNAs在3株淋病奈瑟菌臨床分離株中檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。提示部分sRNAs參與淋病奈瑟菌頭孢曲松耐藥性調(diào)控,并廣泛分布于淋病奈瑟菌中。
【圖文】：

３．１鮑曼不動(dòng)桿菌的１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因鑒定逡逑１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因ＰＣＲ產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，從３６株臨床分離株都能擴(kuò)增出ＤＮＡ片段，逡逑長度與陽性對(duì)照鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ＡＴＣＣ１９６０６擴(kuò)增產(chǎn)物的相同，部分結(jié)果如圖１－１所逡逑示。通過ＤＮＡ測(cè)序并與ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫己公布鮑曼不動(dòng)桿菌１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因序列進(jìn)行同源比逡逑對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中３４株臨床分離株的１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因序列與鮑曼不動(dòng)桿菌１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因序列逡逑高度同源，確認(rèn)為鮑曼不動(dòng)桿菌，部分結(jié)果如圖１－２所示。此外，ＡＢ６測(cè)序結(jié)果與大腸埃逡逑希菌１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因序列高度同源，ＡＢ３１測(cè)序結(jié)果與肺炎克雷伯菌１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因序列高逡逑度同源，，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將這兩株菌排除。逡逑Ｍ邋＋邋＿邐１６Ｓ邋ｒＲ＞邋Ａ基因逡逑ｉａｍｂｐ－逡逑圖１－丨丨％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)部分１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因ＰＣＲ產(chǎn)物逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐａｒｔ邋ｏｆ邋１６Ｓ邋ｒＲＮＡ邋ｇｅｎｅ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｂｙ邋１％邋ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ逡逑注：Ｍ．邋ＤＬｌＯＯＯＯＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋＋．陽性對(duì)照（ＡＴＣＣ１９６０６邋菌液）；－．陰性對(duì)照（ｄｄＨ２０）逡逑＾邐Ｍａｘ邋Ｔｏｔａｌ邋Ｑｕｅｒｖ－邋Ｅ邐ｔ逡逑Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邐－邐ｉｄｅｎｔ邋Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ逡逑ｓｃｏｒｅ邋ｓｃｏｒｅ邋ｃｏｖｅｒ邋

Ｆｉｇ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｉｓｔａｎｔ，邋ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ邋ａｎｄ邋ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ邋ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ邋ｏｆ邋３４邋Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ邋ｂａｕｍａｎｎｉｉ邋ｃｌｉｎｉｃａｌ邋ｉｓｏｌａｔｅｓ逡逑ｔｏ邋ｅａｃｈ邋ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ逡逑如圖１－４所示，３４株臨床分離株中只有１株菌（２．９４％）對(duì)檢測(cè)所用的９類２１種抗生逡逑素全部敏感；多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌為對(duì)３到７類抗生素耐藥的菌株，共８株（２３．５３％）：逡逑廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌為對(duì)８、９類抗生素耐藥的菌株，共２５株（７３．５３％）；未發(fā)現(xiàn)對(duì)全逡逑部９類２１種抗生素產(chǎn)生耐藥性的菌株。提示鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性現(xiàn)象非常嚴(yán)重，為臨床逡逑治療帶來諸多困難。逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R446.5

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本文編號(hào)：2605168