【摘要】：研究背景:作為生物遺傳的基石和遺傳信息的載體,DNA在生命活動中發(fā)揮著重要的作用。高靈敏度的DNA檢測可作為早期檢測人類遺傳和癌癥等疾病的有效手段。上個世紀50年代DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn),開啟了對DNA檢測的研究。傳統(tǒng)的DNA檢測技術主要包括核酸液相雜交、擴增技術和核酸測序技術,其作為核酸檢測的經(jīng)典方法已經(jīng)被廣泛應用于實驗室診斷。隨著納米技術的發(fā)展,基于納米材料的DNA檢測方法也越來越多的涌現(xiàn)出來。其中基于納米金等離子的傳感方法,由于操作簡單,非常適用于Point-of-care Test(POCT)檢測。然而,受限于現(xiàn)有納米金等離子傳感方法的靈敏度,其在核酸檢測上尚不能滿足痕量檢測的需求。研究目的:本研究擬針對聚集型核酸檢測靈敏度低和體系不穩(wěn)定這兩大問題,從解聚傳感的角度出發(fā),利用功能化納米金形成了穩(wěn)定的聚集體,引入靶標后聚集體發(fā)生解聚,即在最開始形成的聚集體即為整個體系的最大聚集,確保加入靶標后聚集體不會沉析,以達到核酸超靈敏檢測的目的。研究方法:本研究基于納米金等離子傳感的原理,對納米金進行表面功能化,利用表面修飾的聚乙二醇(poly ethylen glycol,PEG)和單鏈DNA(single strand DNA,ssDNA)分別在納米金顆粒之間形成空間位阻和靜電互斥,使納米金在溶液中保持穩(wěn)定。另外,特異的ssDNA序列作為識別待測核酸的生物受體,化學惰性的PEG可以促進納米金表面ssDNA的修飾并提高ssDNA對待測核酸的雜交效率。不同于經(jīng)典的待測物誘導聚集的傳感策略,本課題利用納米金耦合效應讓功能化納米金形成一定聚集但不沉析,待測核酸加入后與納米金表面的ssDNA特異結(jié)合,增大納米金之間距離,形成解聚效應。利用紫外可見光光譜儀對整個過程進行檢測,聚集的納米金在局域表面等離子共振(localized surface plasmon resonance,LSPR)光譜上表現(xiàn)為肩峰的增強,加入待測核酸后,由于納米金解聚,LSPR光譜的肩峰強度降低,肩峰強度的改變與待測核酸濃度相關。在此基礎上,我們設計了兩種不同的ssDNA探針:第一種為與待測核酸完全互補的ccpDNA探針作為CCP方法,待測核酸與ccpDNA結(jié)合后,阻斷納米金顆粒間的ssDNA和PEG的相互作用,使納米金解聚;第二種為兩個與待測核酸分別一半互補的hcpDNA1探針和hcpDNA2探針的等比例混合液作為MIX方法,待測核酸的加入后,分別hcpDNA1探針和hcpDNA2探針,形成三明治夾心結(jié)構(gòu),阻斷納米金表面分子間的相互作用的同時,使原本聚集的納米金形成距離一定的納米金集合,由于納米金距離增加,表現(xiàn)出解聚的效果。研究結(jié)果:在對兩種方法的核酸檢測進行方法學研究,我們發(fā)現(xiàn)兩種方法的靈敏度都很高,CCP方法的檢測限為124*10~(-18)M(attoMol,aM),MIX方法的檢測限為2.54*10~(-15)M(femtoMol,fM),可以滿足痕量DNA的檢測,不需要結(jié)合其他擴增策略。在特異性方面,MIX方法比CCP方法的特異性更高,可以識別四個堿基錯配的序列。最后,我們利用雙峰模擬從理論上驗證了本傳感方法定量檢測的有效性。研究結(jié)論:本研究基于功能化納米金的LSPR效應,利用納米金聚集到解聚的非常規(guī)傳感策略,設計了兩種模式的核酸探針,對痕量核酸檢測進行了探索。建立了一種快速、簡單、高靈敏的核酸檢測新方法,為今后應用于臨床痕量核酸檢測提供了實驗依據(jù)。
【圖文】：

20圖 3-1 功能化納米金的合成與 tDNA 檢測策略（a）納米金顆粒表面包裹低分子聚乙二醇（PEG），在表面修飾 DNA 捕獲探針（ccpDNpDNA-1 或 hcpDNA-2）（b）CCP 檢測方法：納米金表面修飾 ccpDNA 探針，通過 ccpDNA 與靶 DNA (tDNA)的直合誘導納米顆粒的解聚。（c）MIX 檢測方法：納米金表面分別修飾兩種半互補的探針，hcpDNA-1 和 hcpDNA-2，例混合，通過一個 tDNA 分子與兩種修飾探針的納米顆粒的結(jié)合誘導納米顆粒的解聚。

圖 3-3 在不同情況下的 MIX 反應溶液情況（a）溶液顏色變化；（b）UV-Vis 結(jié)果1：沒有 PEG 修飾的納米金2：沒有 ssDNA 探針修飾的納米金3：未加入 tDNA 的 ssDNA-PEG 修飾納米金檢測體系4：加入 tDNA 的 ssDNA-PEG 修飾納米金檢測體系（在此研究中 tDNA 的濃度為 10-6M）在使用 hcpDNA-PEG-AuNP 混合物進行檢測的情況下，與 tDNA 的雜交是的。當 tDNA 與單獨的 hcpDNA1-PEG-AuNP 或 hcpDNA2-PEG-AuNP 混合tDNA 濃度下都沒有發(fā)現(xiàn)等離子體帶的改變（圖 3-4c，d）。因此，當溶液NA1 或 hcpDNA2 時，溶液中存在有限的聚集，，tDNA 不與 AuNP 表面的互作用，不能引起納米金聚集體的解聚。
【學位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R440

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本文編號：2605047