【摘要】：研究背景:作為生物遺傳的基石和遺傳信息的載體,DNA在生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用。高靈敏度的DNA檢測(cè)可作為早期檢測(cè)人類遺傳和癌癥等疾病的有效手段。上個(gè)世紀(jì)50年代DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn),開啟了對(duì)DNA檢測(cè)的研究。傳統(tǒng)的DNA檢測(cè)技術(shù)主要包括核酸液相雜交、擴(kuò)增技術(shù)和核酸測(cè)序技術(shù),其作為核酸檢測(cè)的經(jīng)典方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室診斷。隨著納米技術(shù)的發(fā)展,基于納米材料的DNA檢測(cè)方法也越來越多的涌現(xiàn)出來。其中基于納米金等離子的傳感方法,由于操作簡(jiǎn)單,非常適用于Point-of-care Test(POCT)檢測(cè)。然而,受限于現(xiàn)有納米金等離子傳感方法的靈敏度,其在核酸檢測(cè)上尚不能滿足痕量檢測(cè)的需求。研究目的:本研究擬針對(duì)聚集型核酸檢測(cè)靈敏度低和體系不穩(wěn)定這兩大問題,從解聚傳感的角度出發(fā),利用功能化納米金形成了穩(wěn)定的聚集體,引入靶標(biāo)后聚集體發(fā)生解聚,即在最開始形成的聚集體即為整個(gè)體系的最大聚集,確保加入靶標(biāo)后聚集體不會(huì)沉析,以達(dá)到核酸超靈敏檢測(cè)的目的。研究方法:本研究基于納米金等離子傳感的原理,對(duì)納米金進(jìn)行表面功能化,利用表面修飾的聚乙二醇(poly ethylen glycol,PEG)和單鏈DNA(single strand DNA,ssDNA)分別在納米金顆粒之間形成空間位阻和靜電互斥,使納米金在溶液中保持穩(wěn)定。另外,特異的ssDNA序列作為識(shí)別待測(cè)核酸的生物受體,化學(xué)惰性的PEG可以促進(jìn)納米金表面ssDNA的修飾并提高ssDNA對(duì)待測(cè)核酸的雜交效率。不同于經(jīng)典的待測(cè)物誘導(dǎo)聚集的傳感策略,本課題利用納米金耦合效應(yīng)讓功能化納米金形成一定聚集但不沉析,待測(cè)核酸加入后與納米金表面的ssDNA特異結(jié)合,增大納米金之間距離,形成解聚效應(yīng)。利用紫外可見光光譜儀對(duì)整個(gè)過程進(jìn)行檢測(cè),聚集的納米金在局域表面等離子共振(localized surface plasmon resonance,LSPR)光譜上表現(xiàn)為肩峰的增強(qiáng),加入待測(cè)核酸后,由于納米金解聚,LSPR光譜的肩峰強(qiáng)度降低,肩峰強(qiáng)度的改變與待測(cè)核酸濃度相關(guān)。在此基礎(chǔ)上,我們?cè)O(shè)計(jì)了兩種不同的ssDNA探針:第一種為與待測(cè)核酸完全互補(bǔ)的ccpDNA探針作為CCP方法,待測(cè)核酸與ccpDNA結(jié)合后,阻斷納米金顆粒間的ssDNA和PEG的相互作用,使納米金解聚;第二種為兩個(gè)與待測(cè)核酸分別一半互補(bǔ)的hcpDNA1探針和hcpDNA2探針的等比例混合液作為MIX方法,待測(cè)核酸的加入后,分別hcpDNA1探針和hcpDNA2探針,形成三明治夾心結(jié)構(gòu),阻斷納米金表面分子間的相互作用的同時(shí),使原本聚集的納米金形成距離一定的納米金集合,由于納米金距離增加,表現(xiàn)出解聚的效果。研究結(jié)果:在對(duì)兩種方法的核酸檢測(cè)進(jìn)行方法學(xué)研究,我們發(fā)現(xiàn)兩種方法的靈敏度都很高,CCP方法的檢測(cè)限為124*10~(-18)M(attoMol,aM),MIX方法的檢測(cè)限為2.54*10~(-15)M(femtoMol,fM),可以滿足痕量DNA的檢測(cè),不需要結(jié)合其他擴(kuò)增策略。在特異性方面,MIX方法比CCP方法的特異性更高,可以識(shí)別四個(gè)堿基錯(cuò)配的序列。最后,我們利用雙峰模擬從理論上驗(yàn)證了本傳感方法定量檢測(cè)的有效性。研究結(jié)論:本研究基于功能化納米金的LSPR效應(yīng),利用納米金聚集到解聚的非常規(guī)傳感策略,設(shè)計(jì)了兩種模式的核酸探針,對(duì)痕量核酸檢測(cè)進(jìn)行了探索。建立了一種快速、簡(jiǎn)單、高靈敏的核酸檢測(cè)新方法,為今后應(yīng)用于臨床痕量核酸檢測(cè)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

20圖 3-1 功能化納米金的合成與 tDNA 檢測(cè)策略（a）納米金顆粒表面包裹低分子聚乙二醇（PEG），在表面修飾 DNA 捕獲探針（ccpDNpDNA-1 或 hcpDNA-2）（b）CCP 檢測(cè)方法：納米金表面修飾 ccpDNA 探針，通過 ccpDNA 與靶 DNA (tDNA)的直合誘導(dǎo)納米顆粒的解聚。（c）MIX 檢測(cè)方法：納米金表面分別修飾兩種半互補(bǔ)的探針，hcpDNA-1 和 hcpDNA-2，例混合，通過一個(gè) tDNA 分子與兩種修飾探針的納米顆粒的結(jié)合誘導(dǎo)納米顆粒的解聚。

圖 3-3 在不同情況下的 MIX 反應(yīng)溶液情況（a）溶液顏色變化；（b）UV-Vis 結(jié)果1：沒有 PEG 修飾的納米金2：沒有 ssDNA 探針修飾的納米金3：未加入 tDNA 的 ssDNA-PEG 修飾納米金檢測(cè)體系4：加入 tDNA 的 ssDNA-PEG 修飾納米金檢測(cè)體系（在此研究中 tDNA 的濃度為 10-6M）在使用 hcpDNA-PEG-AuNP 混合物進(jìn)行檢測(cè)的情況下，與 tDNA 的雜交是的。當(dāng) tDNA 與單獨(dú)的 hcpDNA1-PEG-AuNP 或 hcpDNA2-PEG-AuNP 混合tDNA 濃度下都沒有發(fā)現(xiàn)等離子體帶的改變（圖 3-4c，d）。因此，當(dāng)溶液NA1 或 hcpDNA2 時(shí)，溶液中存在有限的聚集，，tDNA 不與 AuNP 表面的互作用，不能引起納米金聚集體的解聚。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R440

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本文編號(hào)：2605047