【摘要】：研究背景和目的:關(guān)于毛孢子菌感染的流行病學(xué)研究顯示,毛孢子菌已成為惡性血液病患者真菌血癥中第二大常見的酵母類致病菌。在侵襲性酵母菌感染中,毛孢子菌的致病幾率僅次于念珠菌和隱球菌。阿薩希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)是臨床分離毛孢子菌中最常見的菌種。播散性毛孢子菌病的死亡率高達(dá)50%~80%,在惡性血液病并出現(xiàn)持續(xù)性中性粒細(xì)胞減少患者中,死亡率甚至可達(dá)100%。由于侵襲性或播散性毛孢子菌感染患者病情常迅速變化,快速準(zhǔn)確的診斷方法對于臨床抗真菌藥物的及時合理應(yīng)用、扭轉(zhuǎn)高死亡率局面極其重要。核酸擴增技術(shù)由于可快速高效擴增病原菌特征性核苷酸序列,已在毛孢子菌感染的診斷中得到廣泛應(yīng)用。但是,既往的核酸擴增技術(shù)大多依賴于病原菌純培養(yǎng)、DNA提取和后續(xù)的產(chǎn)物測序才能獲取檢測結(jié)果,嚴(yán)重削弱了核酸擴增技術(shù)的高時效性優(yōu)勢。為提高核酸擴增技術(shù)在毛孢子菌感染診斷中的總體時效性,我們選擇基于菌落PCR技術(shù)(無需復(fù)雜的DNA提取步驟)和重組酶聚合酶擴增技術(shù)(擴增時間10~20min),建立2種分別適用于設(shè)備技術(shù)條件充足和設(shè)備技術(shù)匱乏地區(qū)和機構(gòu)的T.asahii感染快速診斷方法。本研究的第一部分旨在建立一種可以取代核酸擴增前DNA提取過程的T.asahii菌落DNA快速釋放方法,并初步形成T.asahii感染臨床易獲取樣本快速處理策略;第二部分和第三部分旨在基于第一部分研究成果,實現(xiàn)菌落PCR技術(shù)和菌落RPA技術(shù)對T.asahii的特異性快速檢測,并觀察該2項技術(shù)對臨床樣本檢測的適用性;第四部分旨在通過T.asahii播散性感染小鼠模型驗證2種快速檢測方法的實用性。主要實驗方法:第一部分:采用PCR技術(shù)以IGS區(qū)通用引物進(jìn)行擴增,評價玻璃珠法、凍融法、直接法、酶解法和常規(guī)DNA提取法對T.asahii DNA的釋放效率,并觀察最優(yōu)方法處理T.asahii模擬感染臨床樣本的性能。1.以各方法處理后的T.asahii CBS2479濃度梯度菌懸液作為PCR模板擴增,進(jìn)行敏感性檢測;2.以各方法處理后的15株T.asahii菌株10~3CFU/mL的菌懸液作為PCR模板擴增,進(jìn)行陽性率檢測;3.以敏感性、陽性率間接評價4種方法對T.asahii的菌落DNA釋放效率,并與常規(guī)提取法進(jìn)行比較,篩選出一種最優(yōu)的T.asahii菌落DNA快速釋放方法;4.采用響應(yīng)面法對最優(yōu)方法進(jìn)行優(yōu)化,并通過PCR擴增的敏感性變化驗證優(yōu)化后方法DNA釋放效率的提高;5.以最優(yōu)方法為基礎(chǔ)對T.asahii模擬感染的全血、尿液和支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)樣本進(jìn)行處理,以PCR擴增結(jié)果間接評價模擬樣本中T.asahii基因組DNA的釋放效率,并對模擬樣本處理方法做相應(yīng)改進(jìn)。第二部分:建立菌落PCR技術(shù)快速檢測和鑒定阿薩希毛孢子菌的方法。1.基于15個T.asahii IGS區(qū)基因型和近緣菌種IGS序列的比對結(jié)果,手工設(shè)計T.asahii種特異性引物;2.根據(jù)引物對小樣本量菌種的特異性表現(xiàn)進(jìn)行引物篩選,而后基于盲法設(shè)計通過大樣本量菌種驗證最優(yōu)引物特異性;3.觀察菌落PCR技術(shù)對連續(xù)稀釋T.asahii菌懸液和DNA樣本的檢測敏感性;4.采用正交設(shè)計優(yōu)化菌落PCR反應(yīng)體系,通過敏感性檢測水平變化驗證優(yōu)化后菌落PCR擴增效率的提高,并復(fù)核菌落PCR檢測的特異性;5.應(yīng)用凝膠電泳成像和直接熒光顯色法觀察菌落PCR技術(shù)對T.asahii模擬感染樣本的檢測敏感性和檢出率。第三部分:建立菌落RPA技術(shù)快速檢測和鑒定阿薩希毛孢子菌的方法。1.基于第二部分引物設(shè)計所采用的T.asahii與近緣菌種IGS序列差異區(qū),按照RPA引物設(shè)計要求,手工設(shè)計T.asahii種特異性引物;2.應(yīng)用小樣本量菌種觀察引物特異性,并通過溫度梯度擴增優(yōu)化引物特異性;3.基于盲法設(shè)計,應(yīng)用大樣本量菌種驗證引物特異性;4.觀察RPA技術(shù)對連續(xù)稀釋T.asahii DNA樣本的檢測敏感性;5.采用正交設(shè)計優(yōu)化RPA反應(yīng)體系和條件,通過敏感性檢測水平變化驗證優(yōu)化后RPA擴增效率的提高,并復(fù)核RPA檢測的特異性;6.觀察玻璃珠法與RPA技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用對連續(xù)稀釋T.asahii菌懸液的檢測敏感性;7.分別應(yīng)用凝膠電泳成像和直接熒光顯色法觀察菌落RPA技術(shù)對T.asahii模擬感染樣本的檢測敏感性和檢出率。第四部分:在T.asahii播散性感染小鼠模型中驗證菌落PCR技術(shù)和菌落RPA技術(shù)的實用性。1.應(yīng)用環(huán)磷酰胺和地塞米松對小鼠進(jìn)行免疫抑制,通過尾靜脈接種T.asahii,建立T.asahii播散性感染小鼠模型;2.通過真菌鏡檢、液體標(biāo)本和組織勻漿真菌培養(yǎng)、組織病理學(xué)檢查和培養(yǎng)陽性菌株菌落PCR產(chǎn)物測序比對,確證感染菌種及模型建立是否成功,并計算各器官載菌量;3.分別應(yīng)用菌落PCR技術(shù)和菌落RPA技術(shù)對6個時間點的血液、尿液和BALF進(jìn)行檢測。主要實驗結(jié)果:第一部分:玻璃珠法可高效釋放T.asahii菌落DNA,且適用于對全血、尿液和BALF的處理。1.基于玻璃珠法、凍融法處理后的PCR檢測敏感性為3×10~2CFU/mL,直接法、酶解法和常規(guī)DNA提取法的敏感性為3×10~3CFU/mL;2.基于玻璃珠法處理后的PCR檢測陽性率為100%,明顯高于其它4種方法;3.玻璃珠法處理耗時短于除直接法外的其它方法;4.經(jīng)優(yōu)化后玻璃珠法處理后的PCR檢測敏感性提高至3.0×10~1 CFU/mL;5.經(jīng)玻璃珠法處理的3種臨床樣本其PCR檢測敏感性均為3.0×10~1 CFU/mL,且在全血樣本玻璃珠法處理后增加濃縮純化步驟可使PCR檢測敏感性提高1個數(shù)量級。第二部分:T.asahii菌落PCR快速檢測和鑒定方法具有高敏感性和高特異性,適用于對全血、尿液和BALF中T.asahii的直接檢測。1.采用引物TA4F和TA4R的菌落PCR技術(shù)在優(yōu)化前后對非T.asahii菌株均無擴增;2.優(yōu)化后的菌落PCR技術(shù)對T.asahii菌懸液和DNA樣本的檢測敏感性分別為10 CFU/mL和1fg/μL;3.凝膠電泳成像和熒光顯色結(jié)果一致,菌落PCR技術(shù)對模擬感染的全血樣本檢測敏感性為30 CFU/mL,對尿液和BALF的敏感性為10 CFU/mL,對孢子濃度為300CFU/mL的模擬樣本檢出率為100%。第三部分:T.asahii菌落RPA快速檢測和鑒定方法可在短時間內(nèi)快速完成T.asahii的準(zhǔn)確檢測,可直接檢測全血、尿液和BALF中的T.asahii。1.基于引物TA4RPAF和TA4RPAR4的RPA技術(shù)在反應(yīng)溫度為47.5℃時滿足對T.asahii特異性擴增要求;2.優(yōu)化后的RPA技術(shù)檢測T.asahii DNA和菌懸液樣本的敏感性分別為1fg/μL和30 CFU/mL;3.菌落RPA技術(shù)檢測對模擬感染的全血、尿液和BALF樣本的檢測敏感性均為30 CFU/mL,對模擬感染樣本的檢出率均為100%,且凝膠電泳成像和熒光顯色法對敏感性的判讀結(jié)果一致。第四部分:2種檢測方法均可在經(jīng)確證的T.asahii播散性感染小鼠模型全血、尿液和BALF中檢出T.asahii。1.根據(jù)組織培養(yǎng)和測序鑒定結(jié)果,18只實驗組小鼠均出現(xiàn)T.asahii播散性感染,模型建立成功;2.菌落PCR技術(shù)和菌落RPA技術(shù)檢測實驗組血液、尿液和BALF,結(jié)果均為陽性,對照組均為陰性;3.應(yīng)用直接熒光顯色與電泳成像均可對檢測結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確判斷;4.菌落PCR技術(shù)和菌落RPA技術(shù)可在血行播散后6h于小鼠血液、尿液和BALF檢出T.asahii。主要結(jié)論:1.在應(yīng)用核酸擴增技術(shù)檢測前,玻璃珠法可作為高效釋放全血、尿液和BALF中T.asahii DNA的方法,在擴增后可應(yīng)用熒光顯色法直接讀取結(jié)果;2.成功建立了可直接應(yīng)用于全血、尿液和BALF的T.asahii菌落PCR快速檢測和鑒定方法,可用于對T.asahii感染的即時診斷;3.成功建立了可直接應(yīng)用于全血、尿液和BALF的T.asahii菌落RPA快速檢測和鑒定方法,該法操作簡單,耗時極短,可作為設(shè)備或技術(shù)匱乏機構(gòu)即時診斷T.asahii感染的工具;4.可選擇血液、尿液和BALF作為T.asahii播散性感染早期診斷的樣本,2種快速檢測和鑒定方法均可用于T.asahii播散性感染的早期診斷。
【圖文】：

購于荷蘭真菌生物多樣性研究中心株復(fù)蘇挑取凍存的少量菌液接種于 PDA 培養(yǎng)基中，，35℃培DA 培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代，培養(yǎng)條件同樣為 35℃培養(yǎng) 4懸液配制鹽水沖洗多份 PDA 培養(yǎng)基中的菌落，并將沖洗后的菌500rpm 轉(zhuǎn)速離心 1min 后，小心吸取上清棄掉，而后osphate buffer saline，PBS）重新懸浮孢子，再次以 1 PBS 清洗步驟一次后，向離心后沉淀中加入 5mL 生理行 10 倍濃度梯度倍比稀釋，應(yīng)用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)FU/mL。將此菌懸液 1500rpm 離心 1min 后棄掉上清，并用 TE 緩沖液連續(xù)倍比稀釋得到 107、106、105、的菌懸液（圖 1-2）。

1-3 不同菌落 DNA 釋放方法的 PCR 敏感性檢測電泳圖。1-7 的菌懸液濃度依次U/mL、3×106CFU/mL、3×105CFU/mL、3×104CFU/mL、3×103CFU/mL、3×102CFCFU/mL；8：Negative Control；M：DNA Ladder Marker；A：玻璃珠法；B：凍融；D：酶解法；E：常規(guī)提取法。.3.2 陽性率檢測檢驗各種菌落 DNA 釋放技術(shù)對低濃度 T. asahii 的作用，我們選擇了 mL 作為檢測濃度，理想狀態(tài)下，在 PCR 體系中加入上述菌液 2μL，相當(dāng)通過 3 次重復(fù)實驗對 15 株上述濃度菌懸液為模板進(jìn)行 PCR 擴增后，玻 15 條特異性條帶，陽性率為 100%，與其它方法做獨立樣本 t 檢驗，p＜表 1-5)；凍融法 3 次擴增分別得到 11、12、10 條特異性條帶，陽性率%（圖 1-4B）；直接法分別得到 12、12、11 條特異性條帶，陽性率為 73.；酶解法分別可見 14、13、13 條特異性條帶，陽性率 77.78%(圖 1-4D)；分別得到 8、7、9 條特異性條帶，陽性率為 53.33% (圖 1-4E)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R446.5


本文編號：2604099