【摘要】：[背景]慢性腎臟疾病是各種原因引起的慢性腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙,腎間質(zhì)纖維化為慢性腎臟疾病的主要病理改變之一。病理結(jié)果是纖維化診療研究中最為直接的診斷證據(jù),但是作為有創(chuàng)檢查,在臨床應(yīng)用受到限制。血清學(xué)指標(biāo)Ⅲ型膠原蛋白、GFR、白蛋白肌酐比等,影像學(xué)超聲彈性成像、剪切波彈性成像等方法因可重復(fù)、無(wú)創(chuàng)受到研究者關(guān)注。纖維化過(guò)程復(fù)雜,涉及細(xì)胞和分子眾多,目前的指標(biāo)雖然通過(guò)不同角度直接或間接反應(yīng)患者纖維化水平,但是特異性存在不足,研究認(rèn)為肌成纖維細(xì)胞非可逆活化作為纖維化中至關(guān)重要一個(gè)節(jié)點(diǎn),但是缺乏相應(yīng)的檢測(cè)指標(biāo)。特異性標(biāo)記物篩選仍舊是纖維化研究和診療過(guò)程最為主要的挑戰(zhàn)。CD248(內(nèi)皮唾液酸蛋白),屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白。近期研究證實(shí)在病理性纖維化疾病中CD248的表達(dá)明顯上調(diào)。并且其表達(dá)程度與組織的纖維化程度成正相關(guān)關(guān)系。研究認(rèn)為其與肌成纖維細(xì)胞活化密切相關(guān),我們的研究也確定干擾CD248分子可以影響纖維化進(jìn)程。CD248分子能否作為慢性腎臟疾病纖維化進(jìn)程新型診斷標(biāo)志物受到關(guān)注。[研究目的]本研究以尿蛋白陽(yáng)性患者尿液樣本為研究對(duì)象,通過(guò)檢測(cè)尿液中CD248蛋白,結(jié)合患者其它腎損傷相關(guān)指標(biāo)以及疾病特征進(jìn)行分析,從而探討CD248蛋白能否作為慢性腎臟病新型尿液標(biāo)志物。[方法]1.CD248特異性單克隆抗體制備:采用原核表達(dá)CD248重組蛋白免疫小鼠,取免疫成功小鼠脾臟,PEG細(xì)胞融合法進(jìn)行融合獲得雜交瘤細(xì)胞,間接ELISA篩選CD248陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株;雜交瘤細(xì)胞小鼠腹腔注射后,辛酸-硫酸銨法純化腹水中抗體,SDS-PAGE鑒定抗體純化效果;免疫印跡分析抗體與CD248重組蛋白、SJSA-1細(xì)胞CD248蛋白反應(yīng)情況、流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗體與SJSA-1細(xì)胞膜蛋白CD248反應(yīng)情況;ELISA檢測(cè)抗體親和力情況。2.臨床標(biāo)本驗(yàn)證:隨機(jī)挑選5例蛋白尿樣本,免疫印跡檢測(cè)尿液CD248蛋白。收集137例尿液標(biāo)本(健康人尿:10例;Non-CKD蛋白尿:22例;CKD蛋白尿:105例)。其中糖尿病腎病34例;腎移植狀態(tài)13例;IgA腎病9例;慢性腎小球腎炎49例。收集樣本采集當(dāng)日的血肌酐、胱抑素C以及疾病病程相關(guān)數(shù)據(jù),免疫印跡法檢測(cè)慢性腎臟疾病患者尿液樣本CD248,非參數(shù)檢驗(yàn)(行×列表資料的χ2檢驗(yàn))分析與CKD分期、CRF血肌酐分期、胱抑素C含量、疾病病程之間的相關(guān)性。[結(jié)果]1.篩選出6株CD248特異性單克隆抗體(M3F、M3H、M4A、M4B、M4C、M5)。免疫印跡結(jié)果顯示6株抗體均能與MBP-CD248重組蛋白以及SJSA-1表達(dá)的CD248蛋白結(jié)合;流式細(xì)胞檢測(cè)中有3株抗體能夠與SJSA-1表達(dá)的CD248蛋白結(jié)合分別為:M3F、M4C、M5;6株抗體的親和力分別為(單位:mM):M3F:0.07、、M3H:0.07、、M4A:0.08、、M4B:0.10、M4C:0.05、M5:0.32。2.①免疫印跡分析得出CD248在蛋白尿中存在表達(dá);②在Non-CKD中CD248的陽(yáng)性率為:13.6%,在CKD尿液中CD248陽(yáng)性率為:53.3%;P0.05③CKD1-5期尿液中CD248的陽(yáng)性率分別:33.3%、53.3%、55.5%、51.7%、61.3%;P0.05④在CRF肌酐分期中,5組的CD248的陽(yáng)性率分別為:36.6%、61.5%、50%、62.5%、66.7%;P0.05⑤胱抑素C正常參考值組CD248陽(yáng)性率:33.3%,大于參考值上線組陽(yáng)性率:61.2%;P0.05⑥糖尿病腎病病程1-5年、5.1-10年、10.1年以上各組CD248的陽(yáng)性率分別為:50%、52%、66.7%;P0.05;各組CKD的分布情況P0.05;⑦將腎移植分為移植5年內(nèi)與移植5年以上,CD248陽(yáng)性率分別為:14%、50%;兩組CKD的分布情況P0.05。[結(jié)論]1.6株抗體均能與CD248蛋白變性表位結(jié)合;3株抗體能夠結(jié)合CD248空間構(gòu)象位點(diǎn);6株抗體的親和力檢測(cè)中M5親和力最高。2.CD248可具有作為慢性腎臟疾病早期檢測(cè)標(biāo)志物的潛能,以及在反應(yīng)疾病病情進(jìn)展上尿液中CD248的表達(dá)情況可能較CKD更具有臨床價(jià)值。
【圖文】：

３０攝氏度，２５０ｒｐｍ振蕩培養(yǎng)，收集振蕩培養(yǎng)５ｈ時(shí)的菌液。對(duì)收集到逡逑的菌液進(jìn)行裂解和超聲碎菌后進(jìn)行梯度尿素洗滌得到純化后的目的蛋白。用逡逑ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋（圖１－１）對(duì)目的蛋白進(jìn)行純度驗(yàn)證，成功獲得誘導(dǎo)表達(dá)ＭＢＰ－ＣＤ２４８逡逑蛋白，其純化后純度較高，，分子量與預(yù)期相符。逡逑ＫＤａ邋Ｍ邋１逡逑１７０－逡逑１３０－逡逑１００－邋＊逡逑７５－逡逑６０－逡逑４５－逡逑３５－逡逑２５－逡逑圖１－１邋ＭＢＰ－ＣＤ２４８重組蛋白純化結(jié)果逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｐｕｒｉｆｙ邋ｏｆ邋ＭＢＰ－ＣＤ２４８邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑２３逡逑

小鼠血清從１：１邋000起每２倍倍比稀釋，直至血清稀釋至１：１邋０００邋０００。逡逑相關(guān)抗體孵育結(jié)束后進(jìn)行顯色和酶標(biāo)儀檢測(cè)讀數(shù)。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫的４只小逡逑鼠血清中的ＣＤ２４８抗體效價(jià)均達(dá)到１００００００邋（圖１－２；邋１－３），此時(shí)的小鼠可用逡逑于接下來(lái)的雜交瘤細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑？邐－ｔ－邐－邐’邋ｔ逡逑２－ｓ邐ｕｎｋｗｒｉｎｎｉｚｅｄ邐２５邐－＃－Ｎ０．２邋－＃－ｕｎｉｍｍｏｎｕｅｄ逡逑Ｉ邋２邐Ｉ邋２逡逑ｒｏ邐＾逡逑Ｈ邐＼邐１－邐＼逡逑ｉ１邐＼邐１１邋Ｖ逡逑0邋？邋？邋ｋ邋￣？－？？？〉ｏ邋？—？？＿？＿？＿？＿￣逡逑／邋／邋／邋／／／／／／，／／／邋／邋／邋／邋／／／／／，＜／／逡逑圖１－２邐１－２號(hào)小鼠免疫完成后血清效價(jià)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｓｅｒｕｍ邋ｔｉｔｅｒ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｍｏｕｓｅ邋Ｎｏ．邋１－邋２逡逑Ａ：１號(hào)小鼠Ｂ：邋２號(hào)小鼠逡逑藍(lán)色線條：免疫結(jié)束后小鼠血清效價(jià)；紅色現(xiàn)條：陰性對(duì)照血清逡逑２４逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R692;R446.1

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本文編號(hào)：2601882