【摘要】：目的建立基于核酸的肺炎鏈球菌體外變溫?cái)U(kuò)增(包括普通PCR,多重PCR和熒光定量PCR)和環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增分子血清分型方法,從而達(dá)到簡(jiǎn)單快速地對(duì)肺炎鏈球菌進(jìn)行種屬鑒定和血清群/型分型的目的,并對(duì)中國(guó)分離的肺炎鏈球菌菌株進(jìn)行分子血清分型,初步了解中國(guó)肺炎鏈球菌的流行情況以及不同血清群/型的分布狀況;對(duì)侵襲性肺炎鏈球菌19A、19F血清型菌株進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型(MLST)分析,對(duì)來(lái)自中國(guó)的侵襲性肺炎鏈球菌19A、19F血清型的菌株進(jìn)行基因型特征的研究;使用高通量全基因組測(cè)序的技術(shù),分析肺炎鏈球菌全基因組序列,探討不同血清群/型肺炎鏈球菌的遺傳進(jìn)化關(guān)系。方法收集肺炎鏈球菌菌株,對(duì)菌株進(jìn)行生化方面的鑒定和血清分型。尋找血清型特異核酸序列,設(shè)計(jì)并合成引物及探針,檢測(cè)肺炎鏈球菌種屬特異性基因和血清群/型特異性基因,優(yōu)化變溫?cái)U(kuò)增和等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)條件和體系,確定方法的特異性和敏感性,將所建立的方法應(yīng)用于肺炎鏈球菌菌株和標(biāo)本核酸的檢測(cè);針對(duì)從臨床分離得到的侵襲性肺炎鏈球菌19A、19F血清型菌株,用多位點(diǎn)序列分型(MLST)進(jìn)行ST分型,BioNumerics軟件處理分型數(shù)據(jù),對(duì)來(lái)自中國(guó)的侵襲性肺炎鏈球菌19A、19F血清型的菌株聚類(lèi)分析;對(duì)肺炎鏈球菌菌株進(jìn)行高通量全基因組測(cè)序并對(duì)核心基因組進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化的分析,研究中國(guó)臨床分離到的不同血清型肺炎鏈球菌菌株之間的親緣關(guān)系。結(jié)果變溫?cái)U(kuò)增的全部引物和探針能夠特異性對(duì)肺炎鏈球菌進(jìn)行種屬鑒定和血清分型,而等溫?cái)U(kuò)增引物對(duì)肺炎鏈球菌種屬鑒定特異性良好,但只有部分血清群/型分型引物可特異性對(duì)肺炎鏈球菌進(jìn)行血清分型;中國(guó)侵襲性肺炎鏈球菌19A和19F血清型菌株均有多個(gè)ST型,且各有主要的ST型,19A血清型以ST320為主,19F血清型以ST271為主,19A、19F血清型菌株有共同的序列型ST320;不同血清型肺炎鏈球菌全基因組序列(WGS)聚類(lèi)分析表明,WGS分型能夠提供更多的肺炎鏈球菌不同菌株之間的遺傳信息。結(jié)論初步建立了基于核酸的肺炎鏈球菌變溫?cái)U(kuò)增和等溫?cái)U(kuò)增種屬鑒定和血清群/型分型技術(shù),可用來(lái)研究人群中主要流行的肺炎鏈球菌血清群/型;通過(guò)中國(guó)侵襲性肺炎鏈球菌19A、19F血清型菌株的MLST數(shù)據(jù)分析,掌握中國(guó)肺炎鏈球菌的ST型分布情況,分析肺炎鏈球菌莢膜的轉(zhuǎn)換和血清型替換的趨勢(shì),以評(píng)價(jià)肺炎球菌疫苗的應(yīng)用效果;高通量測(cè)序全基因組序列分析,從基因組水平表明了肺炎鏈球菌菌株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。
【圖文】：

3.5.2 擴(kuò)增結(jié)果根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖中所得條帶亮度的差異，優(yōu)化多重 PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系反應(yīng)條件，調(diào)整每對(duì)引物的反應(yīng)濃度，，得到最優(yōu)化的反應(yīng)體系和條件。多重 PCR 擴(kuò)結(jié)果詳見(jiàn)圖 1.2�！� 300 　 200 　 　 400 　 　 30019A 400 269 2 350 290 19F 400 304 33F 450 338　 400 　 　 350 　 　 400 　 　 45011A 400 348 12F 200 376 23F 400 384 4 350 430　 400 　 　 200 　 　 400 　 350 　5 400 443 15B 200 496 20 400 514 9N 200 516　 400 　 200 　 400 　 200 　1 400 555 18C 350 573 7F 200 599 10A 500 628　 400 350 　 　 200 　 　 500 　22F 400 643 17F 500 693 9V 300 816 cpsA 150 160　 400 　 　 500 　 300 　 　 150 　cpsA 150 160 cpsA 150 160 cpsA 150 160150 150 　 150 　

圖 1.3 肺炎鏈球菌 qPCR 擴(kuò)增曲線(xiàn)圖表 1.1 肺炎鏈球菌 qPCR 血清分型 Ct 值血清型 熒光 Ct 值1 FAM 17.343 HEX 16.934 CY5 15.955 FAM 16.846A FAM 16.116B FAM 14.307F CY5 15.529V HEX 17.5114 FAM 19.0918C HEX 16.16
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R446.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2600022