【摘要】：目的:1.采用McSNP法對(duì)位于人FOXO3A非編碼區(qū)SNP位點(diǎn)分型。2.制作FOXO3A及GAPDH內(nèi)參基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,構(gòu)建可長(zhǎng)期、間斷性地對(duì)大量臨床來源樣本進(jìn)行FOXO3A基因表達(dá)的定量檢測(cè)體系。3.分析SNP型對(duì)FOXO3A基因表達(dá)水平的影響。方法:1.分離14位健康獻(xiàn)血者的單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),從中提取基因組DNA及總RNA。2.McSNP分型方法的建立。首先設(shè)計(jì)包含SNP位點(diǎn)的特異性PCR擴(kuò)增引物,應(yīng)用該引物進(jìn)行PCR反應(yīng),然后用限制性內(nèi)切酶切割PCR產(chǎn)物,最后應(yīng)用熔解曲線方法分析酶切產(chǎn)物,確定SNP型。應(yīng)用PCR-限制性核酸多態(tài)性分析(PCR-RFLP)及PCR產(chǎn)物測(cè)序法對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。3.FOXO3A基因表達(dá)定量體系的建立。采用TA克隆的方法構(gòu)建pGMT-FOXO3A、pGMT-GAPDH重組質(zhì)粒,獲得定量標(biāo)準(zhǔn)品,使用該標(biāo)準(zhǔn)品制作定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。設(shè)計(jì)用于FOXO3A基因表達(dá)定量的特異性擴(kuò)增引物,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行多次重復(fù)定量檢測(cè),計(jì)算定量結(jié)果的精密度與偏倚,評(píng)價(jià)定量體系的可檢測(cè)范圍。4.對(duì)10份來源于健康獻(xiàn)血者的DNA及RNA樣本進(jìn)行rs4946936分型和FOXO3A基因表達(dá)定量。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS做獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),比較組間的基因表達(dá)水平差異。結(jié)果:1.14位獻(xiàn)血者rs4946936的McSNP分型結(jié)果及5位獻(xiàn)血者rs2802288的McSNP分型結(jié)果均與RFLP分型法所得結(jié)果一致,PCR產(chǎn)物測(cè)序也驗(yàn)證了上述分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。McSNP分型法中rs4946936為TT型樣本的熔解曲線顯示為Tm值為77.25℃的單峰,TC型顯示為Tm值為77.25℃和71.75℃的雙峰,CC型顯示為Tm值為71.25℃單峰。2.TA克隆藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)顯示質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化成功,對(duì)陽性克隆采用PCR法鑒定,顯示質(zhì)粒中含有目的片段。將質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋制作定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,擴(kuò)增效率在0.9-1.1之間,相關(guān)系數(shù)98%,FOXO3A定量結(jié)果顯示樣本基因表達(dá)水平在1.56×10~6-1.56×10~3copies/μl(Ct值20~30)范圍內(nèi)精密度變異系數(shù)小于5%,偏倚小于7.5%。3.10位獻(xiàn)血者rs4946936 McSNP分型結(jié)果顯示6個(gè)樣本為CC型,3個(gè)樣本為TC型,1個(gè)樣本為TT型。rs4946936 T突變型組(TT和TC型)與CC型組相比,FOXO3A基因表達(dá)水平未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,p0.05。結(jié)論:1.成功建立了基于熔解曲線分析的McSNP分型方法。2.構(gòu)建了可長(zhǎng)期對(duì)間斷來源樣本的FOXO3A基因表達(dá)量進(jìn)行比較的檢測(cè)體系。3.對(duì)10份獻(xiàn)血者的基因表達(dá)水平分析,未見不同rs4946936型別個(gè)體間FOXO3A基因表達(dá)水平具有明顯差異。
【圖文】：

圖 2 rs2802288-s 酶切產(chǎn)物的熔解曲線2.McSNP分型結(jié)果使用 McSNP 法對(duì) 14 個(gè)不同個(gè)體的 rs4946936 分型結(jié)果是：樣本 2、3、4、6、8、9、12、13 為 CC 型，，樣本 1、5、7、11、14 為 TC 型，樣本 10 為 TT 型。 對(duì)

圖 1 rs4946936-s酶切產(chǎn)物的McSNP熔解曲線對(duì)5份DNA樣本，使用引物對(duì)rs2802292s-F/rs2802288s-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用t1消化覆蓋rs2802288位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物，熔解曲線分析顯示：GG型樣本熔解曲線示為單峰，AG型顯示為三峰，AA型顯示為雙峰，見圖2。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R440

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 鄭星星;王建剛;;FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子與心血管疾病的研究進(jìn)展[J];心臟雜志;2014年02期

2 裴艷宏;劉坤祥;;FOXO3a轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展[J];泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2013年04期

本文編號(hào)：2598982