發(fā)布時(shí)間：2020-03-24 10:27

【摘要】：膿毒癥的定義為感染引發(fā)的宿主免疫系統(tǒng)失調(diào)導(dǎo)致的器官功能障礙,致死率高;膿毒性休克為膿毒癥伴隨嚴(yán)重的循環(huán)系統(tǒng)和細(xì)胞代謝功能障礙。膿毒癥以高發(fā)病率和致命性受到廣泛關(guān)注,根據(jù)最近的數(shù)據(jù),美國的膿毒癥病例數(shù)從1996年的387330l例上升到2011年的110萬,預(yù)計(jì)2020年將達(dá)到200萬,膿毒癥導(dǎo)致的死亡率接近心臟病發(fā)作的死亡率,超過了中風(fēng)死亡率;所以早期的干預(yù)治療是非常必要的。盡管膿毒癥治療策略經(jīng)過近二十多年的發(fā)展,液體復(fù)蘇、抗生素治療以及血液透析等技術(shù)已取得了巨大的進(jìn)步,膿毒癥預(yù)后改善仍不明顯。中性粒細(xì)胞是數(shù)量最多的參與固有免疫應(yīng)答的細(xì)胞。膿毒癥早期即宿主受到病原體攻擊時(shí),骨髓內(nèi)的中性粒細(xì)胞迅速動(dòng)員,大量中性粒細(xì)胞在趨化因子的作用下遷移至病灶部位通過吞噬、脫顆粒作用以及形成胞外誘捕網(wǎng)發(fā)揮清除病原體作用。雖然中性粒細(xì)胞對(duì)病原體清除非常重要,但研究已證實(shí)中性粒細(xì)胞與器官功能損傷密切相關(guān)。膿毒癥過程中中性粒細(xì)胞的凋亡延遲以及其激活后釋放的大量炎癥因子引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)可導(dǎo)致組織缺氧和器官功能障礙。程序性死亡蛋白-配體1(programmed cell death protein-ligand 1,PD-L1)是免疫激活的標(biāo)志,其與程序性死亡受體-1的相互作用可抑制抗原特異性免疫反應(yīng),導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞功能障礙、活化的免疫細(xì)胞耗竭及免疫耐受。腫瘤或炎癥環(huán)境可誘導(dǎo)PD-L1在抗原遞呈細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。有研究證實(shí)膿毒癥時(shí)PD-L1也可表達(dá)于中性粒細(xì)胞上,并且PD-L1陽性的中性粒細(xì)胞可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡;同時(shí)有研究表明PD-L1與B7-1分子互為配體,可發(fā)揮抑制淋巴細(xì)胞增殖的作用。那么PD-L1作為傳統(tǒng)的配體,是否可發(fā)揮類似于受體的胞內(nèi)信號(hào)激活作用?此外利用丹麥科技大學(xué)(DTU)的NetPhos2.0 Server程序做磷酸化位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)PD-L1的蛋白序列分析具有類似YXXM結(jié)構(gòu)域,而YXXM序列可與PI3K結(jié)合并活化p85亞基,PI3K/Akt信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。那么PD-L1是否參與膿毒癥時(shí)中性粒細(xì)胞凋亡延遲的調(diào)控?由此在本課題中著重探討膿毒癥患者中性粒細(xì)胞PD-L1的表達(dá)與PI3K/Akt信號(hào)通路及自身凋亡的相關(guān)性。第一部分膿毒癥時(shí)PD-L1調(diào)控中性粒細(xì)胞凋亡的作用【目的】探索膿毒癥時(shí)中性粒細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)水平與其凋亡的關(guān)系�！痉椒ā�1、分離純化健康志愿者靜脈血的中性粒細(xì)胞,并將其分為3組:對(duì)照組(Con)、IFN-γ刺激組、IFN-γ+LPS共刺激組,刺激21小時(shí)后免疫印跡法檢測PD-L1的表達(dá)水平以及流式細(xì)胞儀檢測中性粒細(xì)胞的凋亡率。人急性早幼粒白血病細(xì)胞系(HL-60)具有誘導(dǎo)分化成類中性粒細(xì)胞的特性并且其表達(dá)PD-L1,將其分為對(duì)照組(Control)和維甲酸刺激組(RA組)進(jìn)行刺激,21小時(shí)后流式檢測免疫印跡法檢測PD-L1的表達(dá)水平以及流式檢測HL-60細(xì)胞的凋亡率。2、分離純化膿毒癥患者的中性粒細(xì)胞,流式技術(shù)檢測培養(yǎng)24h后的凋亡率,同時(shí)收集細(xì)胞用免疫印跡法檢測PD-L1的表達(dá)。3、siRNA干擾膿毒癥患者中性粒細(xì)胞PD-L1的表達(dá),21h后免疫印跡法檢測siRNA的轉(zhuǎn)染效率以及流式檢測其凋亡率;利用IFN-γ和LPS刺激健康志愿者中性粒細(xì)胞PD-L1的表達(dá),并利用siRNA干擾PD-L1的表達(dá),21h后免疫蛋白印跡法檢測PD-L1以及流式檢測中性粒細(xì)胞的凋亡率�！窘Y(jié)果】1.共采集6例健康志愿者的中性粒細(xì)胞,經(jīng)IFN-γ和IFN-γ+LPS刺激后,中性粒細(xì)胞PD-L1表達(dá)上調(diào),且培養(yǎng)21小時(shí)后凋亡率明顯降低(P0.01);RA刺激HL-60細(xì)胞系分化成中性粒細(xì)胞,與對(duì)照組相比,RA刺激組PD-L1表達(dá)下調(diào),且其凋亡率明顯增加(P0.01);2.共收集了14例膿毒癥患者中性粒細(xì)胞,培養(yǎng)24小時(shí)后的其凋亡率與PD-L1的表達(dá)水平呈負(fù)性線性關(guān)系(R2=0.4417,P=0.01)。3.siRNA轉(zhuǎn)染膿毒癥中性粒細(xì)胞,其凋亡率明顯升高(P0.01);PD-L1 siRNA轉(zhuǎn)染IFNγ+LPS刺激后的正常中性粒細(xì)胞的凋亡率與單純IFNγ+LPS處理組相比,其凋亡率明顯升高(P0.01)�！窘Y(jié)論】PD-L1在中性粒細(xì)胞上的表達(dá)增加,而中性粒細(xì)胞的凋亡率下降,說明膿毒癥時(shí)中性粒細(xì)胞PD-L1參與自身凋亡作用的調(diào)控。第二部分PD-L1調(diào)控中性粒細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制【目的】探討膿毒癥時(shí)PD-L1調(diào)控中性粒細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制【方法】1.腺癌人肺泡基底上皮細(xì)胞細(xì)胞系(A549)具有易轉(zhuǎn)染特性,常作為轉(zhuǎn)染宿主;PD-L1全長質(zhì)粒(PD-L1FL/GFP)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞系,免疫熒光法檢測已轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞系內(nèi)PD-L1的GFP熒光與p85亞基的FITC熒光的結(jié)合情況。2.人胚腎細(xì)胞系293(HEK293)極少表達(dá)細(xì)胞外配體所需的內(nèi)生受體,且易轉(zhuǎn)染;利用PD-L1全長序列(PD-L1FL/GFP)和胞內(nèi)段敲除(PD-L1TD/GFP)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,免疫共沉淀檢測PD-L1與p85的存在相互作用。3.利用siRNA干擾HL-60細(xì)胞系PD-L1的表達(dá),21小時(shí)后免疫印跡法檢測p AKT和AKT的蛋白水平。4.利用siRNA干擾分離純化的膿毒癥患者中性粒細(xì)胞PD-L1的表達(dá),21小時(shí)后免疫印跡法檢測p AKT和AKT蛋白水平�！窘Y(jié)果】1.攜帶GFP的PD-L1全長質(zhì)粒和胞內(nèi)段敲除質(zhì)粒構(gòu)建成功。免疫熒光雙染法發(fā)現(xiàn)PD-L1的GFP熒光與p85亞基的FITC熒光可重合。2.PD-L1FL/GFP和PD-L1TD/GFP轉(zhuǎn)染HEK294細(xì)胞系行免疫共沉淀后發(fā)現(xiàn)PD-L1可與P85相互作用,且與PD-L1胞內(nèi)段無關(guān)。3.PD-L1 siRNA轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞后,其p AKT水平降低。4.PD-L1 siRNA干擾膿毒癥患者中性粒細(xì)胞后,其p AK水平下調(diào)【結(jié)論】膿毒癥時(shí)PD-L1可調(diào)控中性粒細(xì)胞的凋亡作用,其調(diào)控機(jī)制可能與PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)。
【圖文】：

海軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文三、結(jié) 果（一）中性粒細(xì)胞上 PD-L1 的表達(dá)水平與凋亡率的變化首先利用流式細(xì)胞儀和臺(tái)盼藍(lán)染液分別檢測中性粒細(xì)胞提純的純度和活性，中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞純度達(dá) 95%以上，其活性達(dá) 95%以上。為了說明中性粒細(xì)胞上PD-L1 與其凋亡之間的關(guān)系，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測經(jīng) IFN-γ刺激的中性粒細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖 2-1 所示，正常中性粒細(xì)胞經(jīng) IFN-γ單刺激和 IFN-γ+LPS 共刺激 21小時(shí)后，其凋亡率明顯下降（圖 2-1A），同時(shí) PD-L1 的表達(dá)也增加（圖 2-1B）。

HL-60 細(xì)胞分化后 PD-L1 的表達(dá)與凋亡的關(guān)系Con: control,非處理組；** p<0.01二） 膿毒癥時(shí)中性粒細(xì)胞 PD-L1 的表達(dá)水平與其凋亡題組前期研究已證實(shí)膿毒癥時(shí) PD-L1 在中性粒細(xì)胞上表達(dá)增加，癥時(shí) PD-L1 在中性粒細(xì)胞上的表達(dá)與其凋亡的關(guān)系，本步驟共采癥患者的中性粒細(xì)胞，，培養(yǎng) 24 小時(shí)后通過 PI 染色檢測凋亡率，測膿毒癥患者中性粒 PD-L1 的表達(dá)并行灰度分析，計(jì)算出 PD-L度值，以最大比值為 1，PD-L1 表達(dá)的相對(duì)率=其他組灰度值比例/最）；中性粒細(xì)胞細(xì)胞 PD-L1 的表達(dá)與中性粒細(xì)胞凋亡率呈負(fù)性相7（圖 2-3B 所示）。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R459.7

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本文編號(hào)：2598192