【摘要】：目的:全球每年的育齡夫婦中約15%~20%會出現(xiàn)不孕不育,而其中由于生殖道感染導致不孕的患者達到20%-60%。導致不孕癥發(fā)生的主要病原體為解脲支原體(Ureaplasma urealyticum,UU)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,CT)和淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG),其中沙眼衣原體和解脲支原體導致的泌尿生殖道感染率呈增加趨勢。此外,研究發(fā)現(xiàn)抗精子抗體(Antisperm antibody,A s A b)也是影響不孕的因素之一。本次研究通過對患者以及健康人群血液、陰道分泌物進行檢測分析,探討泌尿生殖道微生物分布特征,為不孕不育的診斷提供更科學的依據(jù)。方法:1.研究對象選取2017年1月-2018年1月于河北北方學院附屬第一醫(yī)院確診的不孕癥且無其他基礎疾病的女性患者50名,年齡22~35歲,平均(27.45±2.54)歲。對照組選擇在本院就診的有正常生育能力的體檢者50名。年齡22~37歲,平均(28.65±2.94)歲。2.入選標準結婚兩年以上、未采取避孕措施,無滴蟲性陰道炎、霉菌性陰道炎及細菌性陰道病等,排除遺傳因素、解剖因素、內(nèi)分泌因素、免疫功能異常,有生育要求。3.熒光定量PCR:選取2017年1月-2018年1月于河北北方學院附屬第一醫(yī)院確診的不孕癥且無其他基礎疾病的女性患者50名,并選擇同期在本院檢查的育齡期健康對照組50名。采集患者陰道分泌物于無菌管,向無菌管中加入1ml滅菌生理鹽水,充分震蕩搖勻,擠干棉拭子,轉移全部液體至1.5ml離心管中,離心12000rpm 5min,棄上清。沉淀中加入50μl DNA提取液,震蕩5~10s,100℃金屬浴10±1min,離心12000rpm/5min。取適量離心后的待測樣本上清,點樣至8連管中,蓋上蓋子,快速離心數(shù)秒,上機。PCR擴增條件:93 2min℃,℃93 45s→℃55 60s 10個循環(huán),℃93 30s→℃55 45s 30個循環(huán)。自動讀取實時熒光定量PCR儀的UU和CT定量值。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA):受試者均在清晨空腹狀態(tài)下抽取靜脈血3~5 ml,而且不做任何抗凝方面的處理,經(jīng)5 min 3000轉離心處理后將血清分離出來,保存于-20℃環(huán)境下,在檢測前將血清解凍,靜置在室溫下,直至溫度平衡。經(jīng)由ELISA法進行測定。檢測操作方法及判斷結果方法嚴格按照分析儀及試劑盒說明進行。其中,每組抗體檢測均設定陰性結果對照組及陽性結果對照組,以波長450nm照射下微孔板孔吸光度值為標準,高于標準值或陰性檢測結果是標準值的2.1倍,可判斷本次檢測結果為陽性。測定患者血液中抗精子抗體(A s A b)及抗核抗體(Antinuclear antibody,ANA)含量。lon PGM?測序系統(tǒng)測序:采集患者以及健康育齡期對照人員陰道分泌物,提取陰道分泌物中DNA。取適量樣品與離心管中,使用無菌水將樣品稀釋為1ng/μl。進行PCR擴增,檢測以及純化。純化后將樣品混合。構建文庫,對樣品進行測序分析。4.檢測結果的統(tǒng)計學分析采用SPSS21.0對數(shù)據(jù)進行分析。計數(shù)資料以例和百分比表示,組與組間率的比較用卡方檢驗,以P0.05表明有統(tǒng)計學意義。數(shù)據(jù)間相關性采用pearson相關進行分析,其中pearson值0代表正相關性,pearson值0代表負相關性。P0.05表示相關性顯著。結果:1 Lon PGM?測序結果沙眼衣原體文庫稀釋20倍后片段大小為370bp,濃度為253.40pg/μl。解脲支原體文庫稀釋50倍后片段大小為429bp,濃度為97.9pg/μl。沙眼衣原體mate-pair文庫片段大小為299bp,濃度為48.57pg/μl。解脲支原體mate-pair文庫片段大小為299bp,濃度為28.10pg/μl。菌株測序沙眼衣原體產(chǎn)生993Mbp的數(shù)據(jù)量,共4737434條reads,平均片段長度為210bp。解脲支原體產(chǎn)生642Mbp的數(shù)據(jù)量,共3461853條reads,平均片段長度為186bp。將全基因組與沙眼衣原體與解脲支原體的基因進行對比,結果與之相符。2 Real-time PCR結果1)不孕組50例患者中UU陽性例數(shù)為19例,陽性率為38%,CT陽性例數(shù)為17例,陽性率為34%。檢測正常對照組50例,其中UU的陽性例數(shù)為5例,陽性率為10%,CT的陽性例數(shù)為4例,陽性率為8%。對兩組UU和CT陽性率進行統(tǒng)計分析,均為P0.005,差異具有統(tǒng)計學意義,不孕組UU、CT陽性檢出率顯著高于對照組2)不孕組UU、CT陽性定量后結果為5.78±1.01,對照組為3.01±1.13(P0.05),兩組定量數(shù)據(jù)均值差異顯著性具有統(tǒng)計學意義,不孕組UU定量數(shù)據(jù)顯著高于對照組。CT定量數(shù)據(jù)結果與分析,不孕組CT陽性為5.39±0.93,對照組為2.76±0.69,t=1.25,P0.05,兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計學意義。3)UU,CT與不孕發(fā)生之間的相關系數(shù)分別為:0.251,0.604(P0.05)。UU和CT與不孕癥發(fā)生之間具有相關性。3血清中抗核抗體、抗精子抗體檢測結果1)不孕組抗核抗體、抗精子抗體的陽性率分別為40%、44%,正常對照組的陽性率分別為6%、8%,對照組與不孕患者之間存在有明顯差異(P0.01)。不孕患者血樣中的兩種抗體含量明顯高于正常對照組。2)血液中抗體表達量,在不孕患者血清中抗核抗體、抗精子抗體的含量分別為2.36±0.23、2.89±0.34。在對照組血清中的含量分別為1.08±0.35、1.35±0.19。不孕組抗體血清含量高于對照組含量(P0.05)。3)抗核抗體,抗精子抗體與不孕癥發(fā)生之間的相關系數(shù)分別為:0.451、0.701,不孕的發(fā)生與患者血清中抗核抗體、抗精子抗體具有相關性(P0.05)。結論:1.陰道感染沙眼衣原體與解脲支原體可能是引起不孕癥的原因;2.機體自身免疫因素,如抗核抗體、抗精子抗體的表達也是引起不孕發(fā)生的因素;3.陰道感染與自身免疫因素共同作用增加不孕癥發(fā)生的幾率;4.陰道感染以及免疫因素的排查同時進行可更準確判斷不孕的發(fā)生。
【圖文】：

基因組DNA提取步驟Fig.1GenomicDNAextractionstep

LonTorrent文庫構建工作流程
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R711.6;R446.5

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