【摘要】：膿毒癥是ICU中常見(jiàn)的危重病癥,其發(fā)生率和死亡率均很高。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)每年有300萬(wàn)膿毒癥患者,約100萬(wàn)人死于膿毒癥。膿毒癥和膿毒性休克的后期會(huì)出現(xiàn)血管功能障礙,即血管低反應(yīng)性和血管滲漏,最終導(dǎo)致多器官功能衰竭,ICU中30%-40%的病人死亡與血管低反應(yīng)性和血管滲漏有關(guān)。針對(duì)膿毒癥血管低反應(yīng)性和血管滲漏的發(fā)生機(jī)制,提出了一系列的治療措施,但這些措施在糾正血管低反應(yīng)性和血管滲漏過(guò)程中存在矛盾現(xiàn)象,如用縮血管藥物增加血管反應(yīng)性的同時(shí),會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白收縮,加重血管滲漏。目前臨床上缺乏協(xié)同治療血管低反應(yīng)性和血管滲漏的措施。周細(xì)胞(Pericyte,PC)是位于小血管、微血管和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍、基底膜內(nèi)的一群具有收縮、分泌和多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),周細(xì)胞參與炎癥、免疫紊亂、血管異常增生等病理生理過(guò)程,在多種疾病如癲癇、阿爾茲海默癥、糖尿病、心肌缺血、肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。而周細(xì)胞能否協(xié)同調(diào)控和保護(hù)膿毒癥后血管舒縮和屏障功能,及其主要作用機(jī)制是什么,目前尚不清楚。據(jù)此,本研究利用盲腸結(jié)扎穿孔(Cecal Ligation and Puncture,CLP)及靜脈注射LPS復(fù)制SD大鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠膿毒癥模型,以及LPS刺激血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC),分別從整體及離體水平研究了周細(xì)胞對(duì)膿毒癥血管反應(yīng)性和血管通透性的協(xié)同保護(hù)作用及機(jī)制。研究?jī)?nèi)容:第一部分膿毒癥周細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化及與血管反應(yīng)性和血管通透性的關(guān)系利用CLP及靜脈注射LPS復(fù)制膿毒癥大鼠及小鼠(周細(xì)胞熒光標(biāo)記)模型,觀察膿毒癥后不同時(shí)相點(diǎn)(6h、12h、24h)腸系膜血管周細(xì)胞數(shù)量和結(jié)構(gòu)的變化;觀察腸系膜血管舒縮反應(yīng)性和血管通透性的變化,及其相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的變化,分析膿毒癥后周細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化與血管反應(yīng)性和血管通透性間的關(guān)系。第二部分輸注外源性周細(xì)胞對(duì)膿毒癥大鼠血管低反應(yīng)性和血管滲漏的協(xié)同保護(hù)作用利用膿毒癥大鼠模型,輸注外源性周細(xì)胞和功能增強(qiáng)的周細(xì)胞(poly(i:C)預(yù)刺激),觀察周細(xì)胞在腸系膜微靜脈上的定植情況,以及輸注周細(xì)胞后對(duì)膿毒癥大鼠腸系膜血管舒縮反應(yīng)性、血管通透性及存活率的影響,以明確周細(xì)胞對(duì)膿毒癥大鼠血管舒縮功能和屏障功能的協(xié)同保護(hù)作用。第三部分周細(xì)胞敲減大鼠血管反應(yīng)性和血管通透性的變化及輸注外源性周細(xì)胞對(duì)血管舒縮功能和屏障功能的回復(fù)作用用CP-673451(PDGFR-β抑制劑)建立周細(xì)胞敲減大鼠模型(藥物敲減模型),觀察周細(xì)胞敲減大鼠在膿毒癥后血管反應(yīng)性和血管通透性的變化情況,以及輸注外源性周細(xì)胞對(duì)血管反應(yīng)性和血管通透性的回復(fù)作用,以進(jìn)一步明確周細(xì)胞對(duì)膿毒癥大鼠血管反應(yīng)性和血管通透性的協(xié)同保護(hù)作用。第四部分周細(xì)胞協(xié)同調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性和血管通透性的作用及機(jī)制1.周細(xì)胞調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞舒縮功能和血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的直接作用利用培養(yǎng)的VSMC和VEC,觀察正常和LPS刺激下周細(xì)胞與VSMC和VEC間直接接觸的情況,以及對(duì)VSMC舒縮功能和VEC屏障功能的直接調(diào)節(jié)作用。2.周細(xì)胞微囊泡(PCMV)協(xié)同調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性和血管通透性的作用及機(jī)制利用培養(yǎng)的周細(xì)胞:(1)觀察周細(xì)胞和功能增強(qiáng)周細(xì)胞分泌微囊泡數(shù)量的變化;(2)觀察PCMV在VSMC和VEC中的吸收情況;(3)觀察PCMV對(duì)整體動(dòng)物和離體細(xì)胞血管反應(yīng)性和血管通透性的影響;(4)觀察PCMV及Poly(i:C)PCMV所含生長(zhǎng)因子、microRNA的數(shù)量、種類的變化,觀察這些活性物質(zhì)對(duì)VSMC收縮功能和VEC屏障功能的影響。主要研究結(jié)果:第一部分膿毒癥周細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化及與血管反應(yīng)性和血管通透性的關(guān)系1.大鼠CLP和LPS致膿毒癥后,腸系膜微血管周細(xì)胞數(shù)量明顯減少、脫落;腸系膜微動(dòng)脈舒縮反應(yīng)性降低、血流速度逐漸減慢、腸系膜上動(dòng)脈p-MLC_(20)表達(dá)降低,腸系膜微靜脈血管通透性增加、血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹、內(nèi)皮連續(xù)性結(jié)構(gòu)破壞、緊密連接明顯開(kāi)放同時(shí)伴有紅細(xì)胞滲出、腸系膜上靜脈ZO-1和VE-cadherin表達(dá)降低。結(jié)果提示膿毒癥后周細(xì)胞的脫落與血管低反應(yīng)性和血管滲漏密切相關(guān)。2.周細(xì)胞熒光標(biāo)記的小鼠膿毒癥后,腸系膜微靜脈及毛細(xì)血管PDGFR-β熒光表達(dá)降低,微血管周細(xì)胞脫落;腸系膜微動(dòng)脈舒縮反應(yīng)性降低,血管滲漏增加、血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹、血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)破壞。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)膿毒癥后周細(xì)胞的脫落與血管低反應(yīng)性和血管滲漏密切相關(guān)。第二部分輸注外源性周細(xì)胞對(duì)膿毒癥大鼠血管低反應(yīng)性和血管滲漏的協(xié)同保護(hù)作用輸注周細(xì)胞可定植于腸系膜微靜脈上,在輸注后24h定植最多。周細(xì)胞輸注后可明顯提升膿毒癥大鼠72h的存活率和存活時(shí)間,明顯改善膿毒癥大鼠血管反應(yīng)性、血管流速及腸系膜上動(dòng)脈p-MLC_(20)的表達(dá);改善腸系膜血管屏障功能、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和增加連接蛋白表達(dá),功能增強(qiáng)(Poly(i:c)預(yù)處理)的周細(xì)胞效果更好。提示外源性周細(xì)胞對(duì)膿毒癥血管反應(yīng)性和血管通透性具有協(xié)同保護(hù)作用。第三部分周細(xì)胞敲減大鼠血管反應(yīng)性和血管通透性的變化及輸注外源性周細(xì)胞對(duì)血管舒縮功能和屏障功能的回復(fù)作用周細(xì)胞敲減大鼠腸系膜微血管周細(xì)胞數(shù)量減少、覆蓋率明顯降低,血管舒縮反應(yīng)性明顯降低,血管通透性明顯增加、血管內(nèi)皮緊密連接明顯開(kāi)放、血管內(nèi)皮連接蛋白表達(dá)明顯降低,周細(xì)胞輸注后可恢復(fù)周細(xì)胞減少導(dǎo)致的血管舒縮功能和屏障功能的破壞。膿毒癥會(huì)加重周細(xì)胞敲減大鼠的血管低反應(yīng)性和血管滲漏,輸注外源性周細(xì)胞可明顯改善周細(xì)胞敲減大鼠膿毒癥后血管反應(yīng)性、血流速度和腸系膜上動(dòng)脈p-MLC_(20)表達(dá),改善血管通透性,增加連接蛋白的表達(dá);功能增強(qiáng)(Poly(i:c)預(yù)處理)的周細(xì)胞效果更好。提示輸注外源性周細(xì)胞對(duì)周細(xì)胞敲減大鼠的血管反應(yīng)性和血管通透性具有回復(fù)作用。第四部分周細(xì)胞協(xié)同調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性和血管通透性的作用及機(jī)制1.周細(xì)胞調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞舒縮功能和血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的直接作用周細(xì)胞與VSMC和VEC可直接接觸形成連接,直接調(diào)節(jié)VSMC的收縮功能和VEC的屏障功能。2.周細(xì)胞微囊泡協(xié)同調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性和血管通透性的作用及機(jī)制周細(xì)胞可通過(guò)產(chǎn)生微囊泡(PCMV)協(xié)同改善VSMC舒縮功能和VEC屏障功能。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),PCMV可通過(guò)攜帶Ang-1、miR-145和miR-132來(lái)發(fā)揮對(duì)VSMC收縮功能和VEC屏障功能的協(xié)同保護(hù)作用。miR-145主要作用于VSMC,抑制Sphk2和S1PR1表達(dá),增加S1PR2和p-MLC_(20)的表達(dá),改善血管平滑肌細(xì)胞舒縮功能;miR-132主要作用于VEC,抑制Sphk2和S1PR2的表達(dá),增加S1PR1、ZO-1和VE-cadherin的表達(dá),改善血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能。提示周細(xì)胞主要通過(guò)分泌微囊泡攜帶Ang-1、miR-145和miR-132作用于血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)對(duì)膿毒癥血管反應(yīng)性和血管通透性的協(xié)同調(diào)控和保護(hù)作用。結(jié)論:1.膿毒癥后腸系膜微血管周細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、數(shù)量減少、覆蓋率降低,在血管低反應(yīng)性和血管滲漏中發(fā)揮重要作用。2.輸注外源性周細(xì)胞可協(xié)同改善膿毒癥血管低反應(yīng)性和血管滲漏。3.周細(xì)胞敲減大鼠腸系膜微動(dòng)脈收縮和舒張反應(yīng)性明顯下降,血管通透性明顯增加,輸注周細(xì)胞后可明顯恢復(fù)周細(xì)胞減少導(dǎo)致的血管舒縮功能和內(nèi)皮屏障功能損傷。4.周細(xì)胞可通過(guò)直接接觸和分泌微囊泡協(xié)同保護(hù)膿毒癥血管反應(yīng)性和血管通透性。直接作用主要是周細(xì)胞與VSMC和VEC直接接觸形成緊密和縫隙連接,產(chǎn)生物理覆蓋和調(diào)節(jié)作用。旁分泌作用主要是周細(xì)胞分泌內(nèi)含多種活性物質(zhì)的微囊泡來(lái)發(fā)揮作用,如Ang-1、miR-145和miR-132。一方面周細(xì)胞分泌攜帶Ang-1的微囊泡,傳遞至VSMC和VEC,增加血管平滑肌細(xì)胞舒縮功能和血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能。另一方面,周細(xì)胞通過(guò)分泌攜帶miR-145和miR-132的微囊泡來(lái)發(fā)揮協(xié)同保護(hù)作用,其中miR-145主要在血管平滑肌細(xì)胞中起作用,它主要是通過(guò)降低Sphk2和S1PR1的表達(dá),增加S1PR2和p-MLC_(20)的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用;miR-132主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞中起作用,它主要是通過(guò)降低Sphk2和S1PR2的表達(dá),增加S1PR1、ZO-1和VE-cadherin的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。
【圖文】：

酸化水平的變化與假手術(shù)組相比，膿毒癥后不同時(shí)相點(diǎn)大鼠腸系膜微動(dòng)脈收縮和舒張反應(yīng)性逐漸降低（圖2A），表現(xiàn)為膿毒癥24h后腸系膜微動(dòng)脈對(duì)NE和Ach的反應(yīng)性分別由正常的100%和 98.9%降低至 30.3%和 38.9%；腸系膜微動(dòng)脈和微靜脈的紅細(xì)胞流速也逐漸減慢，與假手術(shù)組相比，膿毒癥 24h 腸系膜微動(dòng)脈和微靜脈的紅細(xì)胞流速分別降低了 77.8%和

膿毒癥大鼠腸系膜微靜脈及毛細(xì)血管網(wǎng)通透性增加，，具體表現(xiàn)為腸系膜微靜脈和毛細(xì)血管網(wǎng)對(duì)FITC-BSA的透過(guò)率逐漸增加，其中膿毒癥后24h腸系膜微靜脈的滲出從正常的16.6%增加至101.3%（圖3A）；Western blotting結(jié)果顯示，在CLP和LPS制備的膿毒癥模型中，腸系膜上靜脈血管內(nèi)皮緊密連接（ZO-1）和粘附連接（VE-cadherin）蛋白的表達(dá)均逐漸降低，CLP組術(shù)后24h，腸系膜上靜脈ZO-1和VE-cadherin的表達(dá)在模型后24h分別降低了63.1%和64.9%；LPS組術(shù)后24h，腸系膜上靜脈ZO-1和VE-cadherin的表達(dá)在模型后24h分別降低了57.6%和63.1%（圖3B）。免疫熒光結(jié)果顯示，膿毒癥24h后，腸系膜微靜脈內(nèi)皮間ZO-1和VE-cadherin的連續(xù)性破壞、表達(dá)降低（圖3C）。內(nèi)皮超微結(jié)果顯示
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R459.7


本文編號(hào)：2592136