【摘要】：目的:本研究旨在發(fā)展一種利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)直接檢測(cè)miR-93-5p快速簡(jiǎn)便的方法,同時(shí)與RT-qPCR方法檢測(cè)miR-93-5p的結(jié)果進(jìn)行比較,考察兩種方法的檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)特異性的差異。為了得到預(yù)期的檢測(cè)結(jié)果,分別考察了環(huán)形模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)等不同因素,以miR-93-5p的檢測(cè)為例,探討不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的鎖式探針對(duì)滾環(huán)擴(kuò)增的影響,同時(shí)篩選出一條最優(yōu)的鎖式探針鏈用于檢測(cè)miR-93-5p。研究方法:1、RNA structure軟件預(yù)測(cè)不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的鎖式探針。2、細(xì)胞培養(yǎng)。3、利用RCA方法檢測(cè)細(xì)胞中的miR-93-5p。4、利用RT-qPCR方法檢測(cè)細(xì)胞中的miR-93-5p。5、瓊脂糖凝膠電泳。6、聚丙烯酰胺凝膠電泳。結(jié)果:1、本研究所用最優(yōu)鎖式探針是無二級(jí)結(jié)構(gòu)的鎖式探針1。2、鎖式探針和連接序列的最優(yōu)環(huán)化連接終濃度為500 nmol/L。3、環(huán)化連接最優(yōu)時(shí)間為4 h。4、環(huán)化產(chǎn)物最優(yōu)酶切時(shí)間為9 h。5、RCA檢測(cè)miR-93-5p的靈敏度范圍為1 pM~10~4 pM。6、PCR檢測(cè)miR-93-5p的靈敏度范圍為10 pM~10~4 pM。7、RCA和PCR方法檢測(cè)miR-93-5p均具有良好的特異性。8、RCA和PCR方法均可從實(shí)際樣品中檢出miR-93-5p,兩種方法均適用于實(shí)際檢測(cè)。結(jié)論:1、建立了一種基于滾環(huán)擴(kuò)增的恒溫檢測(cè)平臺(tái),開發(fā)了一種快捷、簡(jiǎn)便、靈敏、特異、半定量、經(jīng)濟(jì)有效的檢測(cè)miR-93-5p的新技術(shù)。2、我們用RCA和PCR兩種方法檢測(cè)miR-93-5p,系統(tǒng)的比較了RCA方法和PCR方法檢測(cè)miR-93-5p的靈敏度和特異性。其中,RCA方法的檢測(cè)范圍是1 pM~10~4pM,PCR方法的檢測(cè)范圍是10 pM~10~4 pM,RCA方法較PCR方法的檢測(cè)靈敏度相近。RCA和PCR方法的特異性均良好,可特異的檢測(cè)出miR-93-5p。
【圖文】：

在激發(fā)光的激發(fā)作用下產(chǎn)生強(qiáng)熒光，，通過酶標(biāo)儀收集熒光信號(hào)的變化，從而達(dá)到檢測(cè)miR-93-5p 的目的。反應(yīng)原理如圖1 所示。圖1. 滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè) miR-93-5p 原理圖

預(yù)測(cè)的鎖式探針2的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R440

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本文編號(hào)：2591026