發(fā)布時間：2020-03-19 13:28

【摘要】：引言非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacterium,NTM)是指除了結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌外的所有分枝桿菌菌種。隨著獲得性免疫缺陷綜合征患者和免疫抑制人群的增多,NTM病的發(fā)病率和患病率在全球和我國都呈現(xiàn)上升態(tài)勢,NTM已成為威脅人類健康和生命的重要病原。研究表明NTM在中國的菌種分布有很大的地域差異性,而不同NTM菌種的致病性和藥物敏感性差異很大,了解這種多樣性對指導臨床治療有至關重要的作用。然而在中國,尤其是在NTM患病率高發(fā)地區(qū),NTM流行病學的地域差異性還缺乏系統(tǒng)性數(shù)據。對NTM進行菌種鑒定、藥物敏感性試驗及臨床數(shù)據的分析,對全面理解NTM的生物學特征及臨床診治方案的制定具有重要意義。本研究在我國較大范圍內收集疑似結核感染患者的體液標本,通過傳統(tǒng)的生化檢驗培養(yǎng)出NTM,再通過多靶位基因測序法對上述菌株進行鑒定,分析不同地區(qū)NTM菌種分布的差異性,對NTM優(yōu)勢菌種的藥物敏感性特點及耐藥機制進行了進一步研究,以期為我國NTM流行病學特點和臨床治療決策提供依據。第一部分中國東部和華南地區(qū)非結核分枝桿菌的分布特征研究目的:分析我國NTM感染高發(fā)地區(qū)NTM菌種分布的差異性。方法:收集2012年1月-2014年12來自中國南部的廣州胸科醫(yī)院和中國東部的上海肺科醫(yī)院的臨床NTM分離株。通過對16S rRNA、rpoB、hsp65和16S-23S rRNA基因間隔區(qū)(ITS)進行基因測序完成菌種鑒定分析。結果:(1)共連續(xù)采集NTM臨床分離株1450株。最常見的5種分離株分別是膿腫分枝桿菌復合群(605株,41.7%),鳥胞內分枝桿菌復合群(330株,22.8%),戈登分枝桿菌(244株,16.8%),堪薩斯分枝桿菌(179株,12.3%),偶發(fā)分枝桿菌(50株,3.4%)。(2)上海和廣州NTM菌種的分布存在差異:其中上海NTM臨床分離株共512株,最常見的為鳥胞內分枝桿菌復合群(212株,41.5%)、膿腫分枝桿菌復合群(145株,28.3%)、堪薩斯分枝桿菌(95株,18.6%)。廣州NTM臨床分離株共938株,最常見的為膿腫分枝桿菌復合群(458株,48.8%)、戈登分枝桿菌(211株,22.5%)、鳥胞內分枝桿菌復合群(118株,12.6%)。第二部分中國堪薩斯分枝桿菌亞型分布和克拉霉素耐藥相關性分析研究目的:分析中國患者堪薩斯分枝桿菌亞型分布,并評估不同亞型間的藥物敏感性特點。方法:收集2008-2015年間來自國家耐藥結核監(jiān)控中心13個省份的NTM菌株。將鑒定為堪薩斯分枝桿菌的菌株通過限制性片段分析法分為不同亞型,并對不同亞型的堪薩斯分枝桿菌進行體外藥敏檢測。結果:收集78株堪薩斯分枝桿菌。阿米卡星對堪薩斯分枝桿菌的活性最高,堪薩斯分枝桿菌對不同喹諾酮類藥物的敏感性差異大,對左氧氟沙星的耐藥性(39.7%)明顯高于莫西沙星(16.7%,P=0.001)和加替沙星(19.2%,P =0.005)。對于利福霉素類藥物,利福平耐藥株的比例明顯高于利福布汀耐藥株(P=0.006)。78株堪薩斯分枝桿菌經PCR-restriction enzyme analysis(PRA)分析,共得到4個不同的亞型,即亞型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。其中亞型Ⅰ最為常見(56/78,71.8%)。亞型Ⅰ對克拉霉素的耐藥率明顯高于其它亞型(26.8%;vs4.5%;P=0.031)。在16株對克拉霉素耐藥的堪薩斯分枝桿菌中,9(56.2%)株分離株與23S rRNA基因突變有關。第三部分鳥胞內分枝桿菌復合群感染患者臨床特征分析及藥物敏感性檢測研究目的:收集我國結核病�？漆t(yī)院的NTM病患者臨床分離的菌株,分析其中鑒定為鳥胞內分枝桿菌復合群患者的臨床特征及藥物敏感性特點。方法:收集2011-2013年來自于4家結核病�？漆t(yī)院的分枝桿菌菌株,通過對16S rRNA、rpoB、hsp65和ITS進行基因測序完成菌種鑒定。將鑒定為鳥胞內分枝桿菌復合群的菌株進行體外藥敏實驗并收集相關臨床資料。結果:(1)本研究共收集鳥胞內分枝桿菌復合群253株,其中胞內分枝桿菌188株(41.6%),鳥分枝桿菌65株(14.4%)。(2)胞內分枝桿菌肺病患者年齡≥65歲的比率(41.5%)顯著高于鳥分枝桿菌肺病患者(23.1%)(OR=2.36,95%CI:1.25～4.46,P=0.008);胞內分枝桿菌肺病患者伴發(fā)慢性阻塞性肺疾病者顯著高于鳥分枝桿菌肺病患者(OR=2.84,95%CI:1.56～5.19,P=0.001)。(3)克拉霉素、卷曲霉素和利福布汀對鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌的活性較好,耐藥率均低于5%;而阿奇霉素、左氧氟沙星、加替沙星和鏈霉素對鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌的抗菌效果較差,耐藥率均高于70%。(4)鳥分枝桿菌對莫西沙星和利奈唑胺的耐藥率顯著高于胞內分枝桿菌(10.8%,1.6%,χ2=10.71,P0.05;40.0%,8.5%,χ2=44.71,P0.05);鳥分枝桿菌對利福平的耐藥率顯著低于胞內分枝桿菌(38.5%,66.0%,χ2=9.01,P0.05)。第四部分綜合醫(yī)院膿腫分枝桿菌的流行情況和抗菌藥物敏感性目的:收集了從某綜合醫(yī)院呼吸道標本中分離的膿腫分枝桿菌,分析其藥物敏感性特點。方法:收集2012年4月-2015年3月來自北京某綜合醫(yī)院的分枝桿菌菌株,通過對16SrRNA、rpoB、hsp65和ITS進行基因測序完成菌種鑒定。將鑒定為膿腫分枝桿菌的菌株進行進一步藥敏測定。所選藥物為臨床常用于治療膿腫分枝桿菌復合群感染的13種抗菌藥物。結果:(1)本研究共收集了 61個NTM分離株,其中膿腫分枝桿菌的檢出率位列第二(22/61,36.1%)。(2)克拉霉素對膿腫分枝桿菌菌株具有高度抗菌活性,其MIC50和MIC90分別為0.06μg/mL和8μg/mL。對于氟喹諾酮類藥物,莫西沙星和左氧氟沙星表現(xiàn)出不同的耐藥譜,莫西沙星耐藥率(6/22,27.3%)顯著低于左氧氟沙星(17/22,77.3%)(P0.01)。(3)所有克拉霉素耐藥的膿腫分枝桿菌分離株中均有與克拉霉素耐藥相關的23S rRNA突變。結論(1)NTM在中國的菌種分布有明顯地域差異,膿腫分枝桿菌主要分布在我國南部,胞內分枝桿菌主要分布在我國東部,這種差異或許反映了 NTM菌種在環(huán)境中的分布。(2)我國堪薩斯分枝桿菌的體外藥敏檢測中,阿米卡星是抗菌活性最高的藥物,而克拉霉素的耐藥比例較高。在我國堪薩斯分枝桿菌的分子分型中,占優(yōu)勢的亞型I對克拉霉素耐藥率明顯高于其他亞型。(3)鳥分枝桿菌復合群是我國最常見的NTM之一,且胞內分枝桿菌與鳥分枝桿菌的耐藥譜有明顯差別。臨床中胞內分枝桿菌肺病更易于發(fā)生在老年及具有慢性阻塞性肺疾病的患者中。(4)克拉霉素、阿米卡星、利奈唑胺在體外表現(xiàn)出對膿腫分枝桿菌具有較好的抗菌活性,而左氧氟沙星、亞胺培南和磺胺甲惡唑對膿腫分枝桿菌的抗菌活性較差。位于23S rRNA上的基因突變可以用來預測膿腫分枝桿菌是否對克拉霉素耐藥。
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２．３．２堪薩斯分枝桿菌的亞型逡逑７８株堪薩斯分枝桿菌經ＰＲＡ分析共得到４個不同的亞型，，即亞ＩＩＩ和ＩＶ，見表２．４。其中亞型Ｉ是最常見的，共５６株，占７１．８％，其次共１１株，占１４．１％，最少的是亞型ＩＶ，共３株，占３．８％。逡逑邐表２．４堪薩斯分枝桿菌亞型分布一邋，，邐ｆｅ；？６５ＰＣＲ－ＲＦＬＰ邋特征逡逑菌株數(shù)？邐（％）邐＝~栧危礤澹椋翦味齲ǎ猓穡╁危ǎ猓穡懾危擔叮ǎ罰保福╁危玻矗�，２１０逦１４０，邋１０匚１１（１４．１）逦２４０，邋１３８５逦１４０，�

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