【摘要】：基于金、銀兩種貴金屬納米粒子的特性,構(gòu)建了金納米顆粒銀染色和銀納米簇?zé)晒飧偁帣z測沙眼衣原體兩種方法,為沙眼衣原體檢測提供新的途徑。第一章:分析沙眼衣原體TrpB保守基因序列,設(shè)計兩條特異性的寡核苷酸鏈,一條進行巰基修飾與檸檬酸鈉還原法制備的金納米顆粒結(jié)合得到信號探針,另一條用生物素標記作為捕獲探針。靶序列與兩種探針在包被鏈霉親和素的酶標板內(nèi)形成牢固的帶有金納米顆粒的核酸復(fù)合物。加入銀染色液后金納米催化銀離子還原并聚集在96孔板底部。結(jié)果可通過酶標儀讀取或直接肉眼觀察。檢測體系信號強度與靶序列濃度成正比。對雜交時間、雜交溫度、銀染色時間、探針濃度進行條件優(yōu)化,提高金納米銀染檢測體系的特異性和靈敏性,與其他生殖道病原菌無明顯交叉反應(yīng)。金納米銀染檢測體系最低檢測核酸濃度為55 pmol/L。49例臨床標本檢出率為61%,與實時熒光定量PCR法(Real-time Quantitative PCR,qPCR)相比檢出率無顯著性差異(P0.05)。第二章:設(shè)計兩條DNA銀納米簇鏈構(gòu)建銀納米簇探針檢測體系,通過硼氫化鈉還原法制備兩條互補的低熒光銀納米簇探針,兩條DNA銀納米簇探針會通過堿基互補配對形成銀納米簇對使熒光急劇增強。靶序列與銀納米簇發(fā)生競爭結(jié)合,致使靶序列含量與熒光強度呈反比,結(jié)果通過熒光分光光度計進行檢測。對銀納米簇的穩(wěn)定性、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等條件進行優(yōu)化,提高了銀納米簇探針檢測體系的特異性和靈敏性,重復(fù)性較好,與其他生殖道病原菌無明顯交叉反應(yīng)。銀納米簇探針檢測體系最低檢測核酸濃度為0.29 nmol/L,46例臨床標本檢出率為56%,與熒光定量PCR法相比檢出率無顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:基于金、銀兩種貴金屬納米粒子的特性,建立的沙眼衣原體檢測方法具有良好的靈敏度和特異性,操作相對簡單,成本低廉,是沙眼衣原體的臨床病原學(xué)診斷的更佳途徑。
【圖文】：

12圖 2.1 金納米顆粒銀染檢測方法原理圖Fig.2.1 Principle diagram of silver dyeing method for gold nanoparticles2.3.2 HeLa 細胞培養(yǎng)在 HeLa 細胞進入對數(shù)生長期時對其進行傳代培養(yǎng)。倒掉舊培養(yǎng)基后用高壓滅菌的 PBS 進行潤洗，重復(fù)兩遍后，加入適量 0.25%胰酶細胞消化液。放入37 °C 溫箱消化 1 min 后，用顯微鏡觀察。當(dāng)細胞胞質(zhì)收縮，細胞間隙變大，細胞開始變橢圓時，加入 3~4 ml DMEM（10%FBS）培養(yǎng)基使消化終止，同時用吹打管不斷吹打瓶壁，吹落貼壁細胞并使細胞成為分散單個狀態(tài)；以 1:3 比例轉(zhuǎn)入新的細胞培養(yǎng)瓶中，之后補充 DMEM（10%FBS）培養(yǎng)基至每瓶約 3~4 ml 狀態(tài)。

染核酸雜交法與 qPCR 法進行配對卡方檢驗，以空白孔 A630光度大于臨界值為陽性，低于臨界值為陰性，通過 SPASS 處理。納米顆粒和探針表征檸檬酸鈉還原法制備的金納米顆粒，通過透射電子顯微 電鏡水平下可以觀察到以檸檬酸鈉還原法所制備的金納米聚集，金納米顆粒大小基本一致，，大多數(shù)金納米顆粒的粒（圖 2.2）。為進一步確定所合成金納米顆粒粒徑，本實驗檢測后發(fā)現(xiàn)所制備的金納米顆粒平均粒徑在 20.79 nm 左右 0.048，說明大多數(shù)顆粒粒徑均在 20.79 nm 左右，且呈單峰中沒有其他顆粒雜質(zhì)的影響（圖 2.3）。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R518;R440

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本文編號：2589144