本文關(guān)鍵詞：MiR-346對Graves病小鼠Tfh細胞影響的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:利用重組腺病毒載體Ad E-GFP-h TSHR289誘導(dǎo)小鼠GD模型,并初步探討mi R-346對GD小鼠Tfh細胞的影響。方法:(1)利用電轉(zhuǎn)化的方法將腺病毒骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BJ5183中,獲得含有腺病毒骨架質(zhì)粒的E.coli BJ5183(E.coli BJ5183-p),之后將E.coli BJ5183-p制備成化學(xué)感受態(tài)。(2)利用限制性內(nèi)切酶技術(shù)將h TSHR289插入攜帶GFP基因的p Ad Track-CMV中,然后將重組后的質(zhì)粒p Ad Track-h TSHR289轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli BJ5183-p,利用E.coli BJ5183的重組酶活性,腺病毒骨架質(zhì)粒和p Ad Track-h TSHR289實現(xiàn)同源重組,得到了攜帶有目的基因的重組腺病毒骨架質(zhì)粒(p Ad Easy-GFP-h TSHR289),進一步將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5α中,制備大量拷貝的腺病毒質(zhì)粒。Pac I酶切p Ad Easy-GFP-h TSHR289,將其轉(zhuǎn)染到人胚腎293A細胞,1-2天后,倒置熒光顯微鏡下可見293A細胞表達綠色熒光蛋白,初步判斷其轉(zhuǎn)染效率。(3)大量擴增重組的腺病毒,TCID50法檢測重組腺病毒滴度。在第0、3、6周通過肌肉注射腺病毒免疫刺激雌性BABL/c小鼠。于第10周取小鼠眼球血,ELISA方法檢測小鼠血清TRAb和T4水平,同時取甲狀腺組織做病理學(xué)檢查。(4)流式細胞術(shù)檢測小鼠脾臟和頸部淋巴結(jié)Tfh細胞比例。(5)第0、4、8、12、16天,尾靜脈注射mi R-346到GD小鼠體內(nèi),于第18天處死小鼠,ELISA方法檢測小鼠血清TRAb和T4水平,流式細胞術(shù)檢測小鼠頸部淋巴結(jié)中Tfh細胞的比例,并與對照小鼠進行比較。結(jié)果(1)通過酶切,轉(zhuǎn)接和測序驗證,得到重組質(zhì)粒p Ad Easy-GFPh TSHR289,通過人胚腎293A細胞包裝得到了重組腺病毒(Ad E-GFPh TSHR289)。(2)重組腺病毒具有高滴度和高感染性,TCID50法測得Ad EGFP-h TSHR289的滴度為3.5×109 pfu/ml,Ad E-GFP-CMV的滴度為2.4×109 pfu/ml;ELISA結(jié)果顯示,與對照組小鼠相比,腺病毒Ad EGFP-h TSHR289處理組小鼠,80%的血清中TRAb水平明顯升高(p0.001),60%的血清T4水平升高(p0.01);甲狀腺病理切片顯示,實驗組小鼠的甲狀腺細胞輕度增生,濾泡內(nèi)膠質(zhì)明顯減少。(3)與對照組小鼠相比,GD小鼠頸部淋巴結(jié)中Tfh細胞的比例是顯著增加的(p0.05),而脾臟中則無顯著變化。(4)GD小鼠在mi R-346干預(yù)后,與對照組相比,小鼠血清中TRAb和T4水平都出現(xiàn)顯著性降低(TRAb:p0.05;T4:p0.01)并且小鼠頸部淋巴結(jié)中Tfh細胞的比例也有所下降(p0.05)。結(jié)論(1)利用Adeasy系統(tǒng)得到攜帶h TSHR289的重組腺病毒骨架質(zhì)粒,通過人胚腎293A細胞包裝得到了重組腺病毒。(2)重組腺病毒能夠成功誘導(dǎo)BALB/c小鼠GD的發(fā)生。(3)GD小鼠頸部淋巴結(jié)中Tfh顯著增加。(4)mi R-346能夠下調(diào)Ad E-GFP-h TSHR289誘導(dǎo)的GD小鼠自身抗體的水平。(5)mi R-346能夠抑制GD小鼠頸部淋巴結(jié)Tfh細胞比例的增多。
【關(guān)鍵詞】：miR-346 Graves病 TSHR 腺病毒
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R581;R446
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-16
• 第一章 緒論16-26
• 1.1 Graves病16-17
• 1.1.1 Graves病概述16
• 1.1.2 GD的臨床表現(xiàn)和特征16-17
• 1.1.3 GD的發(fā)病機制17
• 1.2 TSHR17-20
• 1.2.1 TSHR的基因和蛋白結(jié)構(gòu)18-19
• 1.2.2 TSHR的信號傳導(dǎo)19-20
• 1.2.3 TSHR的組織分布20
• 1.3 GD小鼠模型20-22
• 1.3.1 GD的現(xiàn)狀20-21
• 1.3.2 GD動物模型的探索21-22
• 1.3.3 理想GD動物模型的構(gòu)建22
• 1.4 miRNA22-24
• 1.4.1 概述22-23
• 1.4.2 miRNA的生物合成及生物學(xué)功能23
• 1.4.3 miRNA與自身免疫病23-24
• 1.5 本研究的目的、方法、實驗設(shè)計及意義24-26
• 1.5.1 研究目的24
• 1.5.2 研究方法24
• 1.5.3 實驗設(shè)計24-25
• 1.5.4 意義25-26
• 第二章 人TSHR289基因重組腺病毒的制備與鑒定26-44
• 2.1 實驗儀器和材料26-30
• 2.1.1 主要實驗儀器26-27
• 2.1.2 菌種、細胞株及質(zhì)粒27
• 2.1.3 材料和試劑27
• 2.1.4 主要溶液配制27-28
• 2.1.5 相關(guān)質(zhì)粒圖譜28-30
• 2.2 實驗方法30-37
• 2.2.1 電轉(zhuǎn)化E. coli BJ5183感受態(tài)菌制備30-31
• 2.2.2 電轉(zhuǎn)化pAdEasy-131
• 2.2.3 化學(xué)法制備感受態(tài)E. coli BJ5183-p31-32
• 2.2.4 質(zhì)粒pBlueScript II SK (+)-hTSHR289擴大培養(yǎng)和鑒定32
• 2.2.5 目的基因hTSHR289的純化32-33
• 2.2.6 pAdTrack-CMV載體的酶切33
• 2.2.7 目的基因hTSHR289和線性化pAdTrack-CMV載體的連接和鑒定33-34
• 2.2.8 腺病毒載體的重組和鑒定。34-36
• 2.2.9 重組腺病毒載體（pAdEasy-GFP-hTSHR289和pAdEasy-GFP-CMV）的包裝。36-37
• 2.3 實驗結(jié)果37-42
• 2.3.1 pBluescript II SK(+)-hTSHR289的鑒定37-39
• 2.3.2 pAdTrack-hTSHR289的構(gòu)建和鑒定39-40
• 2.3.3 重組腺病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建和鑒定40-41
• 2.3.4 重組腺病毒pAdEasy-GFP-hTSHR289的包裝41-42
• 2.4 討論42-44
• 第三章 GD小鼠模型的構(gòu)建44-53
• 3.1 實驗儀器和材料44-45
• 3.1.1 實驗儀器44
• 3.1.2 實驗材料44-45
• 3.1.3 實驗動物45
• 3.2 實驗方法45-48
• 3.2.1 重組腺病毒的大量擴增45-46
• 3.2.2 動物免疫46
• 3.2.3 組織標本及血清的留取46-47
• 3.2.4 血清TRAb檢測47-48
• 3.2.5 血清T4檢測48
• 3.2.6 小鼠甲狀腺組織的病理學(xué)檢查48
• 3.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析48
• 3.3 實驗結(jié)果48-51
• 3.3.1 TCID50法檢測病毒滴度48
• 3.3.2 血清TRAb（單位U/L）以及T4檢測（單位pg/ml）48-50
• 3.3.3 甲狀腺組織病理切片檢查50-51
• 3.4 討論51-53
• 第四章 GD小鼠模型中Tfh細胞比例的變化53-58
• 4.1 實驗儀器和材料53-54
• 4.1.1 實驗儀器53-54
• 4.1.2 實驗材料54
• 4.1.3 實驗動物54
• 4.2 實驗方法54-55
• 4.2.1 動物模型的構(gòu)建54
• 4.2.2 流式細胞儀檢測小鼠頸部淋巴結(jié)中Tfh細胞比例的變化54-55
• 4.2.3 流式細胞儀檢測小鼠脾臟Tfh細胞比例的變化55
• 4.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析55
• 4.3 實驗結(jié)果55-57
• 4.3.1 小鼠頸部淋巴結(jié)中Tfh細胞比例的變化55-56
• 4.3.2 小鼠脾臟Tfh細胞比例的變化56-57
• 4.4 討論57-58
• 第五章 miR-346對GD小鼠模型的影響58-64
• 5.1 實驗儀器和材料58-59
• 5.1.1 實驗儀器58
• 5.1.2 實驗材料58-59
• 5.1.3 實驗動物59
• 5.2 miR-346對GD小鼠的影響59-60
• 5.2.1 GD小鼠模型的構(gòu)建59
• 5.2.2 miR-346對GD小鼠的干預(yù)59-60
• 5.2.3 檢測血清中TRAb和T4水平60
• 5.2.4 流式細胞儀檢測小鼠淋巴結(jié)中Tfh細胞60
• 5.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析60
• 5.3 實驗結(jié)果60-62
• 5.3.1 miR-346對GD小鼠血清TRAb和T4的影響60-61
• 5.3.2 miR-346對GD小鼠淋巴結(jié)中Tfh的影響61-62
• 5.4 討論62-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻65-81
• 致謝81-82
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章82

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1 彭岳;趙鐵建;謝海源;韋燕飛;;細胞培養(yǎng)實驗中一些細節(jié)問題的探討[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2009年06期

2 鄭麗君;夏文美;童村;;HeLa細胞的培養(yǎng)與使用[J];醫(yī)藥工業(yè);1983年10期

3 李少英;李月秋;朱金玲;;三種細胞生長狀況的觀察[J];佳木斯醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1995年06期

4 嚴國俊;裴燕芳;朱貞宏;吳潔穎;潘金火;;實時細胞電子分析技術(shù)的應(yīng)用研究進展[J];中國藥學(xué)雜志;2014年03期

5 陳必良,穆潤華,馬向東,王德堂,辛?xí)匝?鄭維國,嚴瑞蘭;特異性反義寡核苷酸對含HPV16的SiHa細胞的作用[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2000年03期

6 孟洪弟,戚豫,潘虹,吳希如;無線粒體DNA的ρ°206細胞的培養(yǎng)及其呼吸鏈功能損害[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2000年03期

7 何秉燕;鄧長生;鄒典定;劉湘芬;易有榮;;G-CSF對洛伐他汀誘導(dǎo)的K562細胞內(nèi)酸堿度及凋亡的影響[J];中華血液學(xué)雜志;2006年07期

8 黃靜紅;李德如;閻國富;;蘿卜硫素對HaCaT細胞的影響研究[J];中國美容醫(yī)學(xué);2010年11期

9 章靜波,葉祝三;保護正常組織和細胞——腫瘤化療研究中的一個動向[J];國外醫(yī)學(xué)參考資料(腫瘤學(xué)分冊);1978年01期

10 章靜波;薛新華;;細胞松弛菌素D對EC_a-109細胞的作用[J];解剖學(xué)報;1979年01期

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1 劉令九;趙小琳;岳立廣;徐艷玲;李淑焱;侯麗娟;隋紅;姜崴;謝寶生;李勇;劉兵;李海濱;;細胞工廠培養(yǎng)人胚肺二倍體細胞制備凍干甲型肝炎減毒活疫苗[A];2011中國生物制品年會暨第十一次全國生物制品學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2011年

2 宋征;;應(yīng)用Bhas42細胞試驗檢測22個腫瘤促長基因標志物[A];2013年（第三屆）中國藥物毒理學(xué)年會暨藥物非臨床安全性評價研究論壇論文摘要[C];2013年

3 谷彬;張輝;喻澤蘭;;依地福新對Jurkat細胞生長抑制機制的研究[A];2009醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十一屆全國腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

4 武冬梅;李秀娥;葛莉亞;袁星;;雙酚-A對MCF-7細胞伏安行為的影響[A];第五屆全國環(huán)境化學(xué)大會摘要集[C];2009年

5 李曉飛;呂超;吳小榮;韓慶玲;王杰;易宗春;;鉛和鋁離子對K562細胞紅系分化的影響[A];全國生化/工業(yè)與衛(wèi)生毒理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2010年

6 宋為民;郭波;;復(fù)方甘草酸苷對HaCaT細胞表達AQP3的影響[A];2011全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

7 劉魯明;錢華;陳震;林勝友;黃挺;;參麥注射液對腫瘤細胞環(huán)核甘酸的影響[A];全國中醫(yī)藥科研與教學(xué)改革研討會論文集[C];2000年

8 張雪玲;糜漫天;李等松;韋娜;張乾勇;楊志祥;;Lovastatin對HL-60細胞HMG-CoA還原酶mRNA表達及細胞增殖功能的影響[A];中國營養(yǎng)學(xué)會特殊營養(yǎng)第五屆學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2002年

9 房佰俊;廖聯(lián)明;楊少光;史明霞;趙春華;;胎兒骨髓源原始干細胞分離純化及其生物學(xué)特性的初步研究[A];第九屆全國實驗血液學(xué)會議論文摘要匯編[C];2003年

10 李曉軍;朱傳東;汪萍;賈麗;陳芳芳;夏欣一;陳龍邦;;人Id3基因在A549細胞中的表達及對細胞生長功能的研究[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2008年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 記者 吳春燕 通訊員 寧習(xí)源 吳劍鵬;人類情緒可影響干細胞生長[N];光明日報;2014年

2 馮衛(wèi)東;老化干細胞可轉(zhuǎn)變成年輕干細胞[N];科技日報;2012年

3 常麗君;科學(xué)家闡明核內(nèi)周期運作機制[N];科技日報;2011年

4 本版編輯邋杜華斌 邰舉 毛文波 顧鋼 陳超 何屹 毛黎;2007年世界科技發(fā)展回顧(六)[N];科技日報;2008年

5 通訊員 李靜;廈大教授發(fā)現(xiàn)細胞防癌“玄機”[N];廈門日報;2009年

6 永誠;美發(fā)現(xiàn)控制細胞生長的蛋白質(zhì)[N];中國醫(yī)藥報;2000年

7 記者 張孟軍;加找到刺激干細胞生長分子[N];科技日報;2001年

8 張?zhí)锟?干細胞研究精彩紛呈[N];中國醫(yī)藥報;2011年

9 邵薇/編譯;T細胞的非凡能力[N];北京科技報;2003年

10 經(jīng)天;控制細胞生長的蛋白質(zhì)[N];中藥事業(yè)報;2000年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 蔣淵;缺氧肝癌細胞中HIF-1和NF-κB的相互作用及其分子機制的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 張廣;肝星狀細胞在肝癌細胞惡性行為中的作用及機制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

3 楊小超;陽離子配體修飾的納米金用于細胞轉(zhuǎn)運和微囊自組裝研究[D];重慶大學(xué);2010年

4 葉玲玲;基于生物素誘導(dǎo)表達系統(tǒng)的HEK293細胞多基因代謝工程改造[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

5 梁國斌;產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)谷胱甘肽過程控制與優(yōu)化[D];江南大學(xué);2008年

6 楊海虹;鈣池操縱性鈣內(nèi)流在人肺腺癌A549細胞中的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

7 常玉娟;基于Nrf2/ARE通路辛開苦降方胃康寧對人胃粘膜上皮細胞SOD2、GSTP1相關(guān)調(diào)控機制的研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2015年

8 楊麗君;人Fcα/μR的表達與功能的初步研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

9 李曼;DRC3f及eRF3b在肝病發(fā)生發(fā)展中作用機制的初步研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

10 王永軍;凋亡/增殖平衡失調(diào)在肺癌發(fā)生中作用的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1997年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 柯自立;硫酸鎂對6-羥基多巴胺損傷的SH-SY5Y細胞的保護作用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 李婷婷;細胞穿透肽VP22對抑癌蛋白PTEN體外抗腫瘤作用影響的研究[D];川北醫(yī)學(xué)院;2015年

3 王靜;環(huán)氧化物酶抑制劑NS-398聯(lián)合奧沙利鉑對宮頸癌Hela細胞增殖和凋亡的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 鄭祿祿;番茄紅素對轉(zhuǎn)染SOD1-G93A的PC12細胞線粒體的保護作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 宋晨源;氯化銨對人正常肝細胞系changliver中二氫乳清酸脫氫酶表達的影響[D];鄭州大學(xué);2015年

6 張莉;白藜蘆醇體外抑制腸道病毒71型的作用機制研究[D];蘇州大學(xué);2015年

7 高華武;富硒芪云抗腫瘤作用及其機制的實驗研究[D];安徽中醫(yī)藥大學(xué);2015年

8 宋加奎;丹參對人胃癌SGC-7901細胞化療敏感性的影響[D];安徽中醫(yī)藥大學(xué);2015年

9 許雅鑫;尼古丁對NCI-H1975和NCI-H460細胞促進增殖作用及對PI3K/Akt通路的影響研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

10 高娜;加減駐景方含藥血清對二氯化鈷誘導(dǎo)后ARPE-19細胞表達VEGF及HIF-1α的影響[D];青海大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：MiR-346對Graves病小鼠Tfh細胞影響的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：253350