本文關(guān)鍵詞：血清1α,25-二羥維生素D液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法的建立及其應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：建立一種同位素稀釋高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法測定血清1α,25-二羥維生素D2 (lα,25(OH)2D2)和1α,25-二羥維生素D3 (lα,25(OH)2D3);對基于不同方法學(xué)的1α,25-二羥維生素D(lα,25(OH)2D)檢測系統(tǒng)進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)及比較；應(yīng)用本研究建立的LC-MS/MS方法測定表觀健康人群血清lα,25(OH)2D水平,嘗試建立生物參考區(qū)間。方法：采集分離血清樣本,以同位素標(biāo)記的lα,25(OH)2D3作為內(nèi)標(biāo),正己烷-乙酸乙酯溶液作為提取劑,高速渦旋提取。離心后吸取上清,37℃真空離心干燥。殘?jiān)眉状?水溶液重構(gòu)后應(yīng)用LC-MS/MS分析技術(shù)進(jìn)行分析檢測。采用正離子電噴霧離子化的多離子反應(yīng)監(jiān)測模式,以標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法定量,建立LC-MS/MS法測定lα,25(OH)2D2和lα,25(OH)2D3的方法。對添加不同水平lα,25(OH)2D2和lα,25(OH)2D3標(biāo)準(zhǔn)品的混合人血清連續(xù)五天進(jìn)行重復(fù)檢測,每次檢測每個(gè)水平樣本進(jìn)行3次重復(fù)測定,以考察方法的精密度。同時(shí)評價(jià)血清樣本添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的加樣回收率。收集2015年4月至6月期間北京協(xié)和醫(yī)院173例患者血清,同時(shí)應(yīng)用本研究建立的LC-MS/MS方法和Diasorin化學(xué)發(fā)光免疫測定法(CLIA)檢測血清lα,25(OH)2D3濃度水平并對Diasorin試劑盒檢測線性、精密度等性能進(jìn)行評估。應(yīng)用Excel 2007對檢測精密度等數(shù)據(jù)及血清樣本檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,比較兩種方法的檢測性能及臨床樣本檢測結(jié)果。收集2015年7月至2015年9月期間北京協(xié)和醫(yī)院體檢中心200例表觀健康人血清,其中男性與女性各100人,年齡18～87歲。200例表觀健康人群中,有175例年齡小于65歲,從175例血清樣本中隨機(jī)抽取20例血清用于參考區(qū)間驗(yàn)證,剩余155例血清用于參考區(qū)間建立。用本研究建立的LC-MS/MS法測定血清lα,25(OH)2D3和lα,25(OH)2D2濃度。以非參數(shù)方法估計(jì)樣本的參考區(qū)間,取2.5%-97.5%百分位數(shù)的值作為參考范圍,并采用小樣本驗(yàn)證的方法對參考區(qū)間進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：用LC-MS/MS法在本實(shí)驗(yàn)條件下可同時(shí)檢測血清lα,25(OH)2D2和lα,25(OH)2D3,化合物保留時(shí)間約為4.7 min,分析時(shí)間為10 mmin,特異性高,未見明顯干擾因素�；衔锱c內(nèi)標(biāo)峰面積比與對應(yīng)的濃度線性相關(guān)系數(shù)均大于0.990。lα,25(OH)2D2批內(nèi)和總變異分別為：3.88%～6.35%和5.43%-9.41%,lα,25(OH)2D3批內(nèi)和總變異分別為2.34%-6.79%和5.37%-8.40%。lα,25(OH)2D2和lα,25(OH)2D3的加樣回收率范圍分別為：95.80%-104.21%和95.91%-99.83%。lα,25(OH)2D2和lα,25(OH)2D3的檢測限(LOD)均為5pg/mL,定量限(LOQ)均為10 pg/mL,具有較高的靈敏度。Diasorin CLIA法測定血清la,25(OH)2D3濃度的批內(nèi)變異分別為2.7%、5.0%和5.0%,總變異分別為13.8%、15.0%和13.5%。取高值(167.8 pg/mL)和低值(36.4pg/mL)兩種血清按不同比例混合稀釋,并用Diasorin試劑盒重復(fù)測量檢測,評價(jià)Diasorin CLIA法檢測試劑盒的檢測線性,得到的線性方程為：y=0.916x+3.626(R2=0.991)。173例血清樣本兩種方法檢測結(jié)果的相關(guān)分析方程為：y=0.9614x+4.3977,R2=0.8041。將兩種方法測定173例患者血清樣本結(jié)果作Bland-Altman圖,差值范圍為-23.1 pg/mL～26.1 pg/mL,5.78%(10/173)的樣本檢測結(jié)果落在95%一致性界限以外。LC-MS/MS法獲得人群的95%參考區(qū)間為32.9 pg/mL～112.5 pg/mL。結(jié)論： 本研究成功建立了同時(shí)測定血清lα,25(OH)2D2和lα,25(OH)2D3的LC-MS/MS方法,該方法無需對待測物進(jìn)行衍生化處理,操作簡便、靈敏度好、特異性高,可應(yīng)用于評價(jià)血清1α,25-二羥維生素D的含量。應(yīng)用此方法評價(jià)的CLIA方法性能較好,可用于臨床。應(yīng)用本研究建立的LC-MS/MS方法初步建立的參考區(qū)間。
【關(guān)鍵詞】：1α 25-二羥維生素D_2 1α 25-二羥維生素D_3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 化學(xué)發(fā)光免疫法 參考區(qū)間
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R446.1
【目錄】：

• 中英文縮略詞表5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 引言11-12
• 試劑、儀器和材料12-14
• 1. 化學(xué)試劑12
• 2. 血清樣品12-13
• 3. 儀器設(shè)備13-14
• 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果14-44
• 1. 標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)液的配制14
• 2. 質(zhì)控品制備14-15
• 3. 樣品制備條件的選擇與優(yōu)化15-18
• 3.1 提取方式的確定和優(yōu)化15-17
• 3.2 提取劑的選擇和優(yōu)化17-18
• 4. 質(zhì)譜條件的選擇與優(yōu)化18-20
• 4.1 離子源、檢測模式的選擇18-19
• 4.2 母離子和子離子的選擇19-20
• 5. 液相色譜條件的選擇與優(yōu)化20-25
• 6. 標(biāo)準(zhǔn)曲線25
• 7. 干擾試驗(yàn)25-29
• 7.1 (24R)-24,25(OH)_2D_3、(24S)-24,25(OH)_2D_3和(23R)-23,25(OH)_2D_3標(biāo)準(zhǔn)品的配制26
• 7.2 (24R)-24,25(OH)_2D_3、(24S)-24,25(OH)_2D_3和(23R)-23,25(OH)_2D_3的質(zhì)譜檢測26-27
• 7.3 (24R)-24,25(OH)_2D_3、(24S)-24,25(OH)_2D_3和(23R)-23,25(OH)_2D_3的LC-MS/MS檢測27-29
• 7.4 干擾檢測結(jié)果及結(jié)論29
• 8. 基質(zhì)效應(yīng)評估29-31
• 8.1 樣品制備29-31
• 8.2 LC-MS/MS檢測及結(jié)果31
• 9. 線性、檢測限與定量限31-33
• 9.1 線性31-33
• 9.2 檢測限與定量限33
• 10. 精密度測定33-35
• 11. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法對常規(guī)檢查試劑盒配套質(zhì)控品的檢測35
• 12. 加樣回收率35-36
• 13. 穩(wěn)定性研究36-38
• 13.1 凍融穩(wěn)定性37
• 13.2 提取后樣本穩(wěn)定性37
• 13.3 長期穩(wěn)定性37
• 13.4 新鮮血樣本中待測化合物穩(wěn)定性37-38
• 13.5 穩(wěn)定性結(jié)論38
• 14. LC-MS/MS方法初步應(yīng)用38-41
• 15. 小結(jié)41-44
• 方法應(yīng)用44-50
• 1. CLIA方法的評價(jià)及其與LC-MS/MS法和RIA法的檢測結(jié)果比較44-47
• 1.1 CLIA方法評價(jià)44-45
• 1.2 LC-MS/MS法與CLIA法測定結(jié)果的關(guān)系45-46
• 1.3 RIA檢測結(jié)果與LC-MS/MS和CLIA結(jié)果的比較46-47
• 2 表觀健康人群參考區(qū)間研究47-50
• 討論50-52
• 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 文獻(xiàn)綜述57-68
• 參考文獻(xiàn)63-68
• 致謝68-69

  本文關(guān)鍵詞：血清1α,25-二羥維生素D液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法的建立及其應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：251885